| 铁蛋白重链亚铁氧化酶活性突变体的构建及鉴定 |
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| 引用本文： | 柳彩芝,苗青,薛建奇,潘书红,段相林,樊玉梅.铁蛋白重链亚铁氧化酶活性突变体的构建及鉴定[J].生物技术,2015(2):113-118,123. |
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| 作者姓名： | 柳彩芝 苗青 薛建奇 潘书红 段相林 樊玉梅 |
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| 作者单位： | 河北师范大学生命科学学院 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金项目(“胞质铁蛋白对炎症介质产生和释放的影响及其分子机制的研究”,No.31000632);中国博士后科学基金项目(“JNK1调节L-Ferritin泛素化降解的分子机理研究”,No.20090450922);河北省自然科学基金项目(“JNK活化导致铁蛋白表达降低的分子机理研究”,No.C2010000409)资助~~ |
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| 摘 要： | 目的]构建小鼠铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)亚铁氧化酶活性突变基因的真核表达载体。方法]针对小鼠FTH基因的亚铁氧化酶活性关键位点(K86、E62和H65),设计并合成6条PCR引物。利用重叠延伸PCR技术,获得小鼠FTH基因的突变体m FTH(K86Q、E62K和H65G),简写为m FTH(3M)。然后将m FTH(3M)插入到实验室已有的C端带Flag标签的真核表达载体pc DNA3中,插入位置为多克隆位点区域中限制性内切酶Bam HⅠ和HindⅢ之间,从而得到亚铁氧化酶活性缺失的FTH真核表达载体pc DNA3-m FTH(3M)-Flag。重组质粒经酶切和测序鉴定正确后,用脂质体lipofectamineTM2000将其转染到RAW264.7细胞中,检测细胞中带有Flag标签的m FTH(3M)蛋白的表达。结果]重组质粒酶切得到预期片段,测序显示所构建的m FTH(3M)真核表达载体序列正确,细胞内检测到带Flag标签的m FTH(3M)蛋白信号的强烈表达。结论]实验成功构建了小鼠FTH亚铁氧化酶活性位点基因突变的真核表达载体pc DNA3-m FTH(3M)-Flag。
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| 关 键 词： | 铁蛋白重链 亚铁氧化酶活性 重叠PCR 分子克隆 |
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