苦荞黄酮-3-羟化酶截短体的原核表达与多克隆抗体制备

为了制备苦荞黄酮-3-羟化酶的多克隆抗体,该研究以苦荞种子灌浆期cDNA文库中获得的苦荞黄酮-3-羟化酶基因截短体(truncated Flavanone-3-hydroxylase,TrF3 H)序列为基础,采用PCR扩增F3 H的截短序列编码区(TrF3 H),构建了原核表达载体pET47b-TrF3 H,并转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行诱导表达,将经钴离子螯合层析柱纯化后的目的蛋白切胶回收后制备了高效价的多克隆抗体。结果表明:pET47b-TrF3 H在大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中以包涵体的形式高效表达。蛋白质印迹显示,制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原,天然的黄酮-3-羟化酶蛋白在苦荞的未成熟种子中大量表达。原核表达体系的建立和多克隆抗体的制备为进一步探讨F3H在苦荞中功能奠定了基础。     

苦荞类过敏原的原核表达及多克隆抗体制备

以苦荞种子发育期全长cDNA文库中获得的与甜荞16 kD过敏原同源的基因BALP(Buckwheat Allergenlike protein,BALP; GenBank登录号GO496294)为基础,构建了原核表达载体pET47b-BALP,实现了在大肠杆菌Rosetta gami2 (DE3)中的高效表达,并对诱导...     

水稻N-糖酰胺酶基因 (OsPNGase A) 的克隆及在毕赤酵母中的分泌表达

N-聚糖酶是一类广泛应用于糖蛋白的N-糖基化修饰研究中的去糖基化酶。本研究通过RT-PCR从水稻中克隆了一个高GC含量(69.48%)的N-聚糖酶基因(Os PNGase A,XM_015775832),通过无缝克隆技术构建酵母分泌型表达载体p PICZ(α)A-Os PNGase A,在毕赤酵母SMD1168H中进行诱导表达,发酵液经DEAE Sepharose阴离子交换层析和His Trap HP金属离子螯合层析纯化,产量可达到12.3 mg/L,比活力为258 U/mg。SDS-PAGE结果显示,纯化的Os PNGase A为单一条带且与预期分子量一致。Os PNGase A能作用于水稻中重组表达的人转铁蛋白(TRF)、玉米中重组表达的鸡蛋抗生物素蛋白(Avidin)以及辣根过氧化物酶(HRP),并且对Avidin的酶切效果优于商业化的PNGase F。Os PNGase A反应的最适p H和温度分别为p H 6.0和40℃,在中性和碱性以及含有100 mmol/L还原剂β-ME和DTT的条件下仍具有活性。水稻Os PNGase A的成功表达为植物糖蛋白的研究提供一个新的工具酶,酵母分泌表达体系的建立为PNGase A的大量制备奠定了基础。     

灵杆菌非特异性核酸酶的原核表达、纯化及活性分析

以灵杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增非特异性核酸酶 (Non-specific nuclease,NU) 基因,并克隆到pMAL-c4X载体上构建重组表达载体pMAL-c4X-NU。经测序及 BLASTN发现其与灵杆菌Serratia marcescens核酸酶基因的同源性为97％。将构建的表达载体pMAL-c4X-NU转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导实现了胞内表达78 kDa的麦芽糖结合蛋白-NU融合蛋白 (Maltose-binding protein-NU,MBP-NU),其最佳诱导表达条件为37 ℃,0.75 mmol/L IPTG诱导1.5 h。用Amylose resin纯化得到了目的蛋白。活性检测表明MBP-NU具有同时降解DNA和RNA的活性,在37 ℃、pH 8.0时活性最高,比活力为1.11×106 U/mg,目标蛋白的纯化效率可达10.875 mg/L。纯化的目标蛋白中无蛋白酶活性存在。0.5 mmol/L乙二胺四乙酸 (Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、1 mmol/L苯甲基磺酰氟 (Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF) 以及150 mmol/L KCl对MBP-NU的活性几乎无影响,因此MBP-NU可作为蛋白质纯化过程中核酸的高效降解酶。     

核酸外切酶Ⅷ截短体的重组表达及其在体外DNA重组反应中的应用

核酸外切酶Ⅷ(ExonucleaseⅧ,ExoⅧ)是一种不依赖于ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶,可作为体外DNA重组反应极具应用价值的候选蛋白。目前关于ExoⅧ在体外DNA重组反应中的应用尚未有文献报道。本研究构建了保留完整外切活性的截短ExoⅧ(Truncated exonucleaseⅧ,tExoⅧ)的重组表达载体pET28a-tExoⅧ,实现了tExoⅧ在大肠杆菌中的高效表达,在纯化获得高纯度蛋白的基础上,对体外重组反应的温度、反应时间、同源臂长度等因素进行了优化分析。研究结果表明,tExoⅧ在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,每升可纯化92.40 mg tExoⅧ,比活力为1.21×10~5 U/mg;在10μL的重组体系中,2.5 U的tExoⅧ于25℃反应12.5min随后50℃保温50 min时重组效率最高。添加Pfu DNA聚合酶的体外同源臂延伸策略可以有效提高重组克隆的效率。以转化效率为2.2×10~6 CFU/μg的Mach1T1为受体细胞,对于含有21 bp同源臂的1 kb片段与5.8 kb线性化载体的重组,每微克载体可形成1.1×10~4个重组克隆,且阳性率大于80%。同源臂长度在8–21bp范围内,重组反应效率随着同源臂长度增加而提高。在最佳反应条件下,同源臂长度仅为8bp仍可实现有效的重组反应。ExoⅧ介导的体外重组体系具有酶制备方法简单、对DNA的克隆无酶切位点限制及高重组克隆效率等显著优点,是分子生物学领域具有潜在应用价值的高效基因克隆新体系。