真菌芳香聚酮化合物的合成生物学研究进展*

真菌芳香聚酮化合物是由真菌非还原聚酮合酶(NR-PKSs)催化形成的具有广泛生物活性的一类天然产物。大部分内源真菌菌株存在难培养、致病性或产率低等问题,从根本上限制了真菌芳香聚酮化合物的开发和应用。随着合成生物学和代谢工程的发展,很多具有生物活性的聚酮产物实现了在工业微生物(如酿酒酵母、构巢曲霉等)中的异源生产,相关研究逐渐成为热点。从合成途径解析与挖掘、底盘细胞的构建与改造等方面综述了近年来真菌芳香聚酮化合物的合成生物学研究进展,为未来真菌芳香聚酮化合物人工代谢途径的高效构建和实现工业化生产奠定基础。     

D1蛋白酶的克隆表达、纯化、生物活性测定及多克隆抗体的制备

为了开发以D1蛋白酶作为靶标的新型除草剂,需要对先导化合物的生物活性进行检测和筛选。从菠菜中提取总RNA,逆转录合成cDNA,采用PCR扩增了CtpA的基因,连接至表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达,通过降低IPTG和诱导温度获得了可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤柱层析对重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE和Western blotting结果证实目的蛋白为含有His-tag的融合蛋白。以合成的D1前体蛋白羧基端24肽作为模拟底物,采用高效液相色谱法测定了其水解活性,结果表明活性可达1.10nmol/(mg·min),为文献报道数据的15倍。纯化后的CtpA蛋白免疫日本的长耳大白兔制备多克隆抗体,ELISA法测定其血清抗体的效价高达1:100000。该结果为抑制剂先导化合物的筛选和酶蛋白与化合物的作用机理研究提供了必要的基础。     

真菌芳香聚酮化合物的合成生物学研究进展*

真菌芳香聚酮化合物是由真菌非还原聚酮合酶(NR-PKSs)催化形成的具有广泛生物活性的一类天然产物。大部分内源真菌菌株存在难培养、致病性或产率低等问题,从根本上限制了真菌芳香聚酮化合物的开发和应用。随着合成生物学和代谢工程的发展,很多具有生物活性的聚酮产物实现了在工业微生物(如酿酒酵母、构巢曲霉等)中的异源生产,相关研究逐渐成为热点。从合成途径解析与挖掘、底盘细胞的构建与改造等方面综述了近年来真菌芳香聚酮化合物的合成生物学研究进展,为未来真菌芳香聚酮化合物人工代谢途径的高效构建和实现工业化生产奠定基础。     

重组杆状病毒细小VP2蛋白40L生物反应器放大工艺研究

研究了Sf9细胞生产重组杆状病毒细小VP2蛋白在机械搅拌式生物反应器(STR)中从3L至40L的放大工艺。首先在3L反应器中,通过DO和搅拌转速的优化,使反应器中的VP2蛋白HA效价不低于摇瓶结果。在40L反应器放大时,温度、p H、DO保持不变,根据输入搅拌功率、体积溶氧系数和叶尖线速度等工程参数的计算,得到了该反应器的合理搅拌转速,最终HA效价测定结果与小罐一致。豚鼠免疫试验证实,反应器中表达的VP2蛋白制成疫苗,与HN2011灭活苗及商品化灭活疫苗相比,抗体水平上升较快且高于传统灭活苗。     

P450s在萜类合成方面的合成生物学研究进展 *

细胞色素P450氧化酶能够催化一系列具有区域特异性、立体特异性的化学步骤,并参与许多天然产物如萜类化合物、甾醇以及生物碱的合成。萜类化合物是活性天然产物中的一大类化合物,在医药、香料等领域具有重要价值。萜类化合物的生物合成及合成后修饰需要P450s,但是目前已知P450s较低的催化活性极大地限制了萜类生物合成的效率。因此,迫切需要发掘和改造用于萜类生物合成的高活性P450s,以充分实现其巨大的工业应用潜力。综述了萜类代谢中涉及到的P450s家族以及近年来萜类生物合成中P450s的发掘和工程研究进展,重点介绍了合成生物学扩宽P450s在萜类合成应用中的主要策略,提出进一步加速P450s发掘和P450s工程的可行策略,并针对合成生物学技术为今后P450s在萜类合成中的应用提出建议与展望。