从全血中提取基因组DNA方法的对比研究

目的:建立从全血中提取基因组DNA的方法,并评价提取DNA的产量和质量.方法:分别采用传统酚-氯仿抽提法和试剂盒法制备基因组DNA,比较这两种方法提取DNA的产量、纯度、稳定性以及方法本身的优缺点、费用等.结果:试剂盒法简单快速,但其制备的DNA产率、纯度、稳定性低于酚-氯仿抽提法.结论:采用酚-氯仿抽提法可以提取较高质量的基因组DNA,适用于下游的分子生物学实验.     

在活细胞中应用FRET技术研究TGFβ/TβRI信号传导

转移生长因子β(TGFβ)信号传导通路参与调节细胞的增殖、分化、凋亡、细胞迁移等一系列细胞过程,与骨代谢疾病的发病机制密切相关.本研究根据荧光共振能量转移(FRET)技术原理,构建包含CFP-TβRI-YFP融合蛋白的TβRI生物传感器,转染293T细胞,观察转染效率.以TGFβ1为诱导剂,激活TGFβ/TβRI信号传导通路,在活细胞生理条件下,动态监测TβRI生物传感器的FRET效应.结果表明,成功构建了TβRI生物传感器,转染细胞效率达50%,在TGFβ1诱导刺激6min后,FRET效率增加并达到最大值,该过程经历9 min后,随时间的延长,FRET效率下降.研究结果表明:在活细胞生理条件下,TGFβ1/TβRI信号转导过程存在一定的时间特异性.     

CD27／CD27L 在肝癌患者血清中的含量及临床意义

目的:探讨原发性肝癌患者外周血中CD27和CD27L的含量及其临床意义。方法:采用ELISA法检测38例肝癌患者和40例健康查体者外周血中CD27及CD27L蛋白的含量,并分析两者与病理类型和临床分期的关系。结果:与健康查体组相比,肝癌患者外周血中CD27蛋白含量未检测到明显变化(t=1.760,P=0.082),但CD27L蛋白含量显著升高(t=39.982,P<0.001)。Spearman秩相关分析表明CD27和CD27L之间无显著相关性(rs=0.305,P=0.084)。CD27在不同病理类型和不同病理分期的肝癌患者血清中的含量无统计学差异(P>0.05);CD27L蛋白含量在III期和发生淋巴结转移的患者中显著升高(P<0.05)。结论:CD27/CD27L通路与肝癌的恶性进展和淋巴结转移有密切关系。     

体外修饰树突状细胞诱导免疫耐受的研究

目的:探讨体外联合应用白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)和甲基强的松龙(methylprednisolone,Medron)修饰供体树突状细胞(dendritic cell,DC)对小鼠皮肤移植术后免疫耐受的诱导效果,为抗移植术后免疫排斥反应治疗提供依据。方法:以健康成年C57BL/6小鼠为供体。BALB/c小鼠为受体,随机分为6组。除A组外,其余各组均于皮肤移植前3d自尾静脉输入对应的供体DC。具体对应关系如下:A组为空白对照,尾静脉输入生理盐水;B组为输入未修饰的DC;C组为20μg/L IL-10处理组;D组为10mg/L Medron处理组:E组为20μg/L IL-10 10mg/L Medron处理组。同时设立F组,为BALB/c对BALB/c的同种同基因皮片移植。各组行皮肤移植术,观察受体移植皮片存活情况。结果:E组的移植皮片存活时间最长,与其它各处理组相比P＜0．05,存在统计学差异。结论:用IL-10和甲强龙修饰的供体树突状细胞对受体进行预处理,可明显延长移植皮片的存活时间。     

转化生长因子β信号转导通路的生物传感器的构建

为构建转化生长因子β信号转导通路的下游蛋白Smad3的生物传感器,根据已发表的人类Smad3基因序列设计引物,利用PCR扩增得到了一个长度约为1.3 kb的Smad3基因全长序列.序列分析结果表明与数据库公布的人类序列(Genebank登录号:NM_005902.3)一致.通过基因工程的方法,构建含有增强的青色荧光蛋白-Smad3-黄色荧光蛋白变体(ECFP-Smad3-Citrine)融合蛋白的真核表达载体即:Smad3生物传感器.转染293T细胞并观察转染效率和融合蛋白表达情况.在荧光显微镜下,应用MetaFlour FRET 4.6软件测量Smad3生物传感器的荧光能量共振转移(flurorescence resonance energy transfer,FRET).经过PCR和双酶切鉴定结果表明:成功构建Smad3生物传感器质粒.细胞转染后转染效率达40%,并检测到FRET现象.分析表明:Smad3生物传感器能够作为活细胞分子探针研究转化生长因子β信号转导通路.