非小细胞性肺癌患者Runx3基因启动子区甲基化状态研究

目的:分析非小细胞性肺癌(NSCLC)中Runx3基因启动子区甲基化状态.方法:运用甲基化特异性PCR技术检测62例NSCLC组织和癌旁正常肺组织中Runx3基因启动子甲基化,并分析该基因启动子甲基化Runx3基因mRNA和蛋白表达的影响及其与临床特征之间的关系.结果:NSCLC组织中Runx3基因异常甲基化率(48.4%)显著高于癌旁正常肺组织中Runx3基因的异常甲基化率(17.7%,P＝0.000);发生完全或者不完全甲基化的NSCLC组织或者正常肺组织中Runx3基因mRNA和蛋白表达显著降低.Runx3基因启动子区高甲基化和肿瘤分化程度及临床分期有相关性(P＝0.041和0.009),而与NSCLC患者性别、年龄、有无吸烟史及肿瘤类型等临床特征无关(P=0.400,0.301,0.290和0.965).结论:Runx3基因启动子区异常甲基化是导致Runx3基因在NSCLC中表达下调的重要因素,有望成为NSCLC早期辅助诊断的分子标志物之一.     

食管癌LAPTM4B mRNA表达及其启动子区甲基化

研究溶酶体相关4次跨膜蛋白B（lysosome associated protein transmembrane 4 beta,LAPTM4B）基因在食管癌中的表达,及其启动子区甲基化状态,为进一步揭示LAPTM4B在不同肿瘤中表达高低机理提供参考.采用半定量RT-PCR法,确定42对食管癌中LAPTM4B mRNA表达.采用5对肝癌中LAPTM4B mRNA表达做内对照（利用灰度值比较）,分析该基因在食管癌中的表达强度.选取其中3对食管癌组织样品（癌组织和癌旁正常组织）,提取基因组DNA,采用亚硫酸氢钠修饰法,联合基因测序法分析LAPTM4B启动子区是否有甲基化修饰位点存在.结果发现,在42对食管癌组织中,癌组织和癌旁正常组织LAPTM4B mRNA表达存在差异：癌组织中LAPTM4B mRNA表达阳性为37/42（88.1%）,癌旁正常组织中LAPTM4B mRNA表达阳性为26/42（61.9%）.经基因测序法分析3对食管癌组织经通用引物PCR扩增的片段,发现1例癌旁正常组织样品中有3个CpG位点.以上结果表明,LAPTM4B基因与肝癌比较在食管癌中低表达,其启动子区1例癌旁正常组织在靠近转录起始点上游-418、-416和-398位置,存在3个CpG位点,而其他2例癌旁正常组织和3例癌组织中,没有发现CpG位点.这提示,LAPTM4B基因启动子区甲基化是其表达调节的重要方式.     

肝细胞癌中FHIT基因启动子甲基化状态分析及其与临床病理特征之间的关系研究

目的:分析肝细胞癌组织中FHIT基因启动子甲基化状态及其与FHIT基因表达和肝细胞癌临床病理特征的关系。方法:运用甲基化特异性PCR(MSP)方法分析肝细胞癌组织和癌旁正常肝脏组织中FHIT基因启动子甲基化状况;应用RT-PCT和Western免疫印迹方法检测FHIT基因mRNA和蛋白的表达情况;统计学分析FHIT基因启动子甲基化与肝细胞癌临床病理特征的关系。结果:MSP分析结果表明肝细胞癌组织中FHIT基因甲基化率(60.8%)显著高于癌旁正常组织中FHIT基因甲基化(16.2%;x2=31.071,P=0.000)。同时我们还发现:发生完全或者部分甲基化的肝细胞癌组织或者癌旁正常肝组织中FHIT基因mRNA和蛋白表达水平显著降低。FHIT基因启动子甲基化和肝细胞癌患者的临床分期和肝外转移情况密切相关(P=0.006和0.049),而与其他临床病理特征无相关性(P>0.05)。结论:FHIT基因甲基化是导致FHIT基因在肝细胞癌中失活的一个重要因素,与肝细胞癌的发生密切相关,有望成为肝细胞癌早期诊断的分子检测标志物和分子治疗新靶点。     

脑胶质瘤组织中p16基因启动子区CpG岛甲基化检测及其临床意义研究

目的：研究脑胶质瘤中p16基因启动子区甲基化情况及其临床意义。方法：用甲基化特异性PCR技术检测42例脑胶质瘤组织和癌旁正常脑组织中p16基因启动子甲基化,并分析该基因启动子甲基化与临床病理特征之间的关系。结果：脑胶质瘤组织中p16基因异常甲基化率（38.27%）显著高于癌旁正常脑组织中p16基因的异常甲基化率（8.8%,P=0.000）。发生甲基化的肿瘤组织或者正常脑组织中p16基因mRNA和蛋白表达显著降低。此外,p16基因异常甲基化和肿瘤病理分级有相关性（P=0.007）,而与患者性别、年龄及肿瘤类型等临床特征无关（P=0.669,0.869和0.944）。结论：p16基因启动子区CpG岛高甲基化与p16表达下调相关,推测p16启动子区CpG岛高甲基化是导致p16基因在脑胶质瘤中表达下调的重要因素,有望成为脑胶质瘤早期辅助诊断的分子标志物之一。     

β-catenin在食管鳞癌中的异常表达及临床意义

目的探讨β-catenin基因在食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的表达及其意义。方法免疫组化法检测65例ESCC及20例因ESCC手术切除的远切端正常食管黏膜组织中β-catenin的表达及定位,分析其与临床病理学参数的关系;RT-PCR检测31例新鲜ESCC及相应的远切断正常食管黏膜组织中β-catenin mRNA的表达。结果免疫组化结果显示:在20例因ESCC手术切除的远切端正常食管黏膜组织中,β-catenin主要位于胞膜;在65例ESCC组织中,β-catenin的胞质积累阳性率为63.1%,胞核积累阳性率为30.8%;β-catenin的胞质/核积累与淋巴结转移相关(P=0.005),但与患者的年龄、性别、肿瘤的分化程度及浸润深度等无关。RT-PCR结果显示:在31例ESCC及相应的远切端正常食管黏膜组织中,均检测到β-catenin mRNA的表达,与相应的远切端正常食管黏膜组织比较,癌组织中β-catenin基因mRNA的表达水平明显升高(P=0.037),其中表达升高的21例,占67.7%,表达无明显差异的8例,占25.8%,表达降低的2例,占6.5%。结论在ESCC中存在β-catenin mRNA表达水平的升高以及β-catenin蛋白的异常胞质/胞核积累,并与淋巴结转移有关。     

结肠癌组织RASSF1A基因转录表达和启动子区甲基化研究

目的:研究Ras相关区域家族1A基因(ras association domain family 1A,RASSF1A)启动子区甲基化对结肠癌组织中该基因转录和表达的影响.方法:应用甲基化特异性PCR(Methylation-special PCR,MSP)、RT-PCR和Western blot方法检测30例结肠癌组织和癌旁组织中的RASSF1A基因启动子区甲基化状态、mRNA和蛋白表达水平.结果:①RASSF1A基因启动子区在结肠癌纽织和正常组织中的甲基化频率分别为57%(17/30)和20%(6/30),甲基化频率在两组具有统计学差异(p＜0.01),,结肠癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化频率显著高于癌旁正常组织(x2=8.531,p＜0.01);②结肠癌组织中RASSF1A基因mRNA和蛋白袁达均显著低于癌旁组织(癌组织和癌旁正常组织中mRNA相对表达量分别为0.2836±0.0493和0.5092±0.0433,P＜0.001;以上组织中蛋白相对表达量分别为0.3124±0.0472和0.5320±0.0440,P＜0.01);③在结肠癌组织中,甲基化组RASSF1A基因mRNA和蛋白表达明显低于非甲基化组(甲基化组和非甲基化组mRNA相对表达量分别为0.0686±0.0174和0.5511±0.0486,P＜0.0001;以上组中蛋白相对表达量分别为0.1219±0.0326和0.5614±0.0380,P＜0.0001).结论:结肠癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化明显增高,与该基因蛋白表达减少显著相关,这可能是导致结肠癌中RASSF1A抑癌基因失活的主要因为.     

NF2基因甲基化及其mRNA表达与乳腺癌发病的关系

目的:探讨乳腺癌中NF2基因启动子甲基化状态及其mRNA水平与乳腺癌发病的关系.方法:应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测47例乳腺癌组织及相应的癌旁组织和15例乳腺良性病变组织,分析NF2基因的甲基化与某些临床参数及mRNA表达的关系.结果:NF2基因启动子区在乳腺癌、癌旁和乳腺良性病变组织中的甲基化频率分别为57.4%(27/47)、23.4%(23/47)和0%(0/15).且乳腺癌组明显高于其余两组(P＜0.05).NF2基因发生甲基化与发病年龄、组织分型、转移和组织分级无相关性.乳腺癌组NF2基因mRNA的相对表达量(0.16±0.11)明显低于相应的癌旁组(0.27±0.14)及乳腺良性病变组(0.64±0.17)(P＜0.05).NF2基因启动子区甲基化频率与其mRNA表达呈负相关(Spearman's r=-0.314,P＜0.05).结论:NF2基因发生甲基化与乳腺癌的发生密切相关,NF2mRNA表达与NF2基因启动子高甲基化呈负相关.     

Wnt/β-catenin信号通路对重度子痫前期患者胎盘滋养层细胞侵袭和增殖的影响

为了阐明Wnt/β-catenin信号通路在子痫前期发生发展中的作用机制,本研究应用RT-PCR检测了子痫前期和正常妊娠妇女胎盘中的Wnt1、β-catenin和cyclinD1的mRNA水平。通过Western blotting检测了Wnt1、β-catenin、Dickkopf-1 (DKK1)和糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)蛋白的表达水平。使用免疫组化定位胎盘中Wnt1、β-catenin和DKK1蛋白的表达。研究显示,与对照组正常胎盘相比,重度子痫前期胎盘中Wnt1、β-catenin和cyclinD1的mRNA表达水平显著降低。Western blotting结果显示,对照组Wnt1、β-catenin和GSK-3β蛋白表达水平显著升高,而DKK1表达水平显著降低。此外,与对照组相比,子痫前期组胎盘中Wnt1和β-catenin的染色强度较弱,而DKK1的染色强度明显增强。说明子痫前期患者胎盘中Wnt/β-catenin信号通路及其下游靶基因被抑制,导致滋养层的侵袭和增殖能力降低,从而促进了子痫前期的发生发展。     

Nucleostemin基因在非小细胞肺癌组织中的表达及意义

目的探讨Nucleostemin(NS,核干细胞因子)基因在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达及临床意义。方法利用RT-PCR法检测13对NSCLC组织和癌旁正常组织中NS mRNA的表达;采用免疫组织化学SP法检测73例NSCLC组织和13例癌旁正常组织中NS蛋白的表达,并分析与NSCLC患者临床病理特征的关系。结果 NSCLC组织中NS mRNA相对表达强度(0.848±0.305)显著高于癌旁正常组织(0.153±0.020)(t=8.712,P0.01)。NS蛋白在NSCLC中的表达率为58.9%(43/73)显著高于癌旁正常组织中的表达率0%(0/13)(χ2=15.315,P0.01)。NS蛋白的表达率与NSCLC的组织类型及分化程度相关,腺癌组织的表达率为76.5%(26/34)明显高于鳞癌组织的表达率43.6%(17/39)(χ2=8.113,P0.01);低分化组织的表达率81.5%(22/27)明显高于高、中分化组织的表达率45.7%(21/46)(χ2=9.023,P0.01),而与患者性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期及淋巴结转移无关(P0.05)。结论 NS基因mRNA及蛋白在NSCLC组织中高表达,对肿瘤细胞的恶性增殖起了重要作用,是一个新的有应用价值的肿瘤分子标志物。     

MAT2A与NDRG2基因在结直肠癌中表达情况及临床意义的研究

目的研究MAT2A(甲硫氨酸腺苷转移酶2A)和NDRG2(N-Myc下游调节基因-2)基因在结直肠癌组织中的表达及两者的相关性,为结直肠癌的研究及治疗提供重要参考。方法选取68例术中切除结直肠癌组织及相应的癌旁组织标本,应用RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)和Western blotting(蛋白质印迹法)检测结直肠癌中MAT2A和NDRG2表达水平。结果结直肠癌中MAT2A和NDRG2mRNA表达情况:MAT2A阳性表达率(66.2%,45/68)高于癌旁组织(7.4%,5/68);NDRG2阳性表达率(36.8%,25/68)低于癌旁组织(91.2%,62/68);两者的表达与患者年龄、性别、肿瘤生长位置等因素均无关,与癌肿临床分期、分化水平及淋巴结转移密切相关。癌肿组织中MAT2A蛋白表达量相较于癌旁组织明显增多(t=39.1152,P=0.0000),而癌肿组织中NDRG2蛋白表达量较癌旁组织明显降低(t=46.5103,P=0.0000);且在结直肠癌组织中两基因的表达可能有相关性(χ~2=7.41,P=0.009)。结论在结直肠癌组织中MAT2A表达增高,NDRG2表达下降,两者与肿瘤的发生发展具有一定相关性,推测可能与DNA甲基化异常有关,但具体机制仍待进一步研究。     

Epigenetic inactivation of SPINT2 is associated with tumor suppressive function in esophageal squamous cell carcinoma

Hepatocyte growth factor activator inhibitor type 2 (SPINT2), a Kunitz-type serine proteinase inhibitor, has been identified as a putative tumor suppressor gene silenced by promoter methylation. We aimed to investigate whether SPINT2 might act as an esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) tumor suppressor gene. Four ESCC cell lines, Fifty-two ESCC tissues and twenty-nine neighboring non-cancerous tissues were included in this study. The expression of SPINT2 was monitored by real time PCR. Bisulfite genomic sequencing and methylation-specific PCR were used to analyze methylation status. The effect of SPINT2 on cell proliferation and apoptosis in EC109 and EC9706 cells was observed by CCK-8 assay and flow cytometric analysis. We found that silencing of SPINT2 was associated with promoter methylation in ESCC cell lines. The densely methylated SPINT2 promoter region was confirmed by bisulfite genomic sequencing. Ectopic expression of SPINT2 inhibited cell proliferation through inducing cell apoptosis in vitro. Furthermore, methylation-specific PCR analysis revealed that SPINT2 promoter methylation was prominent in carcinoma tissues (52.08%) compared with neighboring non-cancerous tissues (22.58%). Kaplan–Meier analysis showed that patients with SPINT2 hypermethylation had shorter survival time. The tumor suppressor gene of SPINT2 is commonly silenced by promoter hypermethylation in human ESCC and SPINT2 hypermethylation is correlated with poor overall survival, implicating SPINT2 is an underlying prognostic marker for human ESCC.     

骨肉瘤中RASSF1A基因的甲基化状态研究

目的：分析骨肉瘤组织中RASSF1A基因甲基化状况。方法：运用甲基化特异性PCR（MSP）分别检测44例骨肉瘤组织及相应的癌旁组织中RASSF1A基因启动子甲基化状态并分析其临床病理意义。结果：骨肉瘤组织中RASSF1A基因异常甲基化率（61.4%）显著高于癌旁正常骨组织中RASSF1A基因的异常甲基化率（20.5%）,二者之间差异具有统计学意义（P〈0.05）。RASSF1A基因异常甲基化导致组织中RASSF1A基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低。另外,RASSF1A基因异常甲基化和肿瘤组织分化程度及全身有无转移情况有相关性（P值分别为0.022和0.016）,而与患者年龄、性别、肿瘤位置及大小等临床特征无关（P值分别为0.6944,0.977,0.786和0.831）。结论：RASSF1A基因启动子高甲基化可能是导致其在骨肉瘤中表达水平降低的分子机制之一,有望成为骨肉瘤早期辅助诊断的一个重要分子标志物。     

5-杂氮-2′-脱氧胞苷诱导鼻咽癌细胞株Syk基因启动子去甲基化的研究

利用5-杂氮-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine,5-aza-CdR）处理体外培养的鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2及永生化非癌性人鼻咽上皮细胞株NP-69,采用BS-PCR、Q-RT-PCR及Westernblot方法分别检测经5μmol/L的5-aza-CdR处理前后,各细胞株中Syk基因启动子甲基化状况及SykmRNA和蛋白质表达情况。探讨去甲基化药物5-杂氮-2′-脱氧胞苷（5-aza-CdR）对鼻咽癌细胞株中脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase,Syk）启动子甲基化水平及其表达的影响。结果显示,Syk基因启动子甲基化水平与鼻咽癌细胞分化程度呈负相关,两种鼻咽癌细胞株的Syk mRNA和蛋白质表达水平显著低于NP-69细胞（P〈0.01）;经5-aza-CdR处理后两种鼻咽癌细胞株的Syk基因启动子甲基化水平降低,Syk mRNA及蛋白质表达升高（P〈0.05）;高分化鼻咽癌细胞株对药物敏感性高于低分化鼻咽癌细胞株（P〈0.01）。由此可见,两种鼻咽癌细胞株中存在不同程度的Syk基因启动子甲基化状态,5-aza-CdR能有效逆转鼻咽癌细胞株Syk基因启动子的甲基化状态,升高Syk mRNA及蛋白质表达,同时鼻咽癌细胞分化程度越高恢复Syk基因表达的比率越高。     

Methylation of secreted frizzled-related protein 1 (SFRP1) promoter downregulates Wnt/β-catenin activity in keloids

Keloid, a benign skin disorder, forms during wound healing in genetically susceptible individuals. To better control keloid and understand the molecular mechanisms, this study screened gene hypermethylations of GEO database microarray data on keloids and identified the hypermethylation of the secreted frizzled related protein-1 (SFRP1) promoter. Subsequently, hypermethylation and mRNA and protein levels were assessed in 57 cases of keloid vs. normal skin tissues. Fibroblasts from tissues were isolated for the assessment of gene regulation in vitro. The methods used were bioinformatic analysis, lentiviral infection carrying SFRP1 cDNA, qRT-PCR, western blot, immunohistochemistry, luciferase reporter assay, methylation-specific PCR and methylated DNA immunoprecipitation-qPCR, ELISA, and/or 5-Aza-2′-deoxycytidine treatment. The data revealed that the SFRP1 promoter was hypermethylated in keloid tissues, compared with that in normal skin tissues. The SFRP1 promoter methylation contributed to the downregulation of SFRP1 mRNA and protein in keloid tissues and keloid fibroblasts. The 5-Aza treatment significantly upregulated SFRP1 mRNA and protein level in keloid fibroblasts. Furthermore, the knockdown of DNMT1 expression, and not the expression of DNMT3a or DMNT3b, was responsible for the hypermethylation of the SFRP1 promoter and upregulation of SFRP1 mRNA and protein in keloid fibroblasts. In addition, the infection of lentivirus carrying SFRP1 cDNA significantly inhibited the signaling activity of Wnt/β-catenin and the mRNA and protein expression of β-catenin and α-SMA in keloid fibroblasts. In summary, the lost SFRP1 expression-induced Wnt/β-catenin signaling due to the hypermethylation of the SFRP1 promoter could associate with keloid development, suggesting that SFRP1 might be a therapeutic target for keloid treatment.     

LMP gene promoter hypermethylation is a mechanism for its down regulation in Kazak’s esophageal squamous cell carcinomas

Abnormal hypermethylation of CpG islands not only associated with tumor suppressor genes can lead to repression of gene expression, but also contribute to escape of the tumor from immune surveillance and contribute significantly to tumorigenesis. In the present study, we studied the hypermethylation of low molecular-weight protein (LMP) gene and its regulation on protein expression in biopsies from resected tissues from Kazak’s esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) patients and their neighboring normal tissues. LMP2 and LMP7 genes promoter region methylation sequences were maped in esophageal cancer cell line Eca109 by bisulfite-sequencing PCR and quantitative detection of methylated DNA from 30 pairs of Kazak’s ESCC and adjacent normal tissues by MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA, USA) and LMP2 and LMP7 protein expression were analyzed with immunohistochemistry. In Eca109, we identified 6 CG sites methylated from all of 22 CpG sites of LMP7 gene. However, no methylation was found for LMP2. The analysis of the data resulted from the quantitative analysis of single CpG site methylation by Sequenom MassARRAY platform, has shown that the methylation level between two groups CpG sites (CpG_5, CpG_9, CpG_20, CpG_21 and CpG_20) from CpG_1, CpG_2, CpG_3, CpG_4, CpG_5, CpG_6, CpG_7, CpG_8, CpG_9, CpG_10.11, CpG_12.13.14, CpG_15.16.17.18, CpG_19, CpG_20, CpG_21 and CpG_22 significant differences between ESCC and neighboring normal tissues. The analysis of methylation level of whole target CpG fragment indicated that the methylation level of LMP7 was significant higher in ESCC (0.0517 ± 0.0357) than in neighboring normal tissues (0.0380 ± 0.0214, P < 0.05). there was a tendency of decreasing the LMP7 proteins expression as the increasing the methylation level of LMP7 gene promoter regions (F = 7.69, P = 0.041). The LMP7 gene promoter methylation and protein downregulation were correlated at high extent in Kazakh’s ESCC patients, and may explain the epigenetic regulation on gene expression.     

类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞 IL-10 基因启动子甲基化状态研究

白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）是在类风湿性关节炎中发挥重要免疫调节作用的细胞因子,其基因失活与已分化的Th1和Th2细胞染色质结构重塑有关。为了探讨IL-10基因启动子甲基化及基因失活在类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)发病和进展中的作用,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及甲基化特异性聚合酶链反应(MSP), 分别检测34例类风湿性关节炎患者和30例健康人外周血单个核细胞 IL-10 mRNA、蛋白表达水平及基因启动子甲基化状态。结果显示,病例组IL-10 mRNA及蛋白表达均低于健康对照组,无统计学差异（P>0.05）。病例组甲基化率(85.29%)高于健康对照组(43.33%), 具有统计学差异(x² =12.439,P=0.000)。IL-10基因启动子甲基化状态与其mRNA表达呈显著负相关(r=-0.579, P=0.001), 与所累关节数显著相关,但与血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、类风湿因子(RF)、年龄均无相关性(P>0.05)。IL-10 mRNA表达与年龄、所累关节数、ESR、CRP及RF均无相关性(P>0.05)。上述结果提示,启动子甲基化可能是IL-10基因失活的重要机制,IL-10基因异常高甲基化状态可能参与了RA的发生发展。