山羊品种间体细胞核移植研究

萨能奶山羊是著名的奶用山羊品种,波尔山羊则是世界著名的肉用山羊品种.为了研究波尔山羊体细胞在奶山羊卵母细胞中的去分化,我们将成年波尔山羊的颗粒细胞或耳皮肤成纤维细胞作为供核细胞(试验组),移入奶山羊中Ⅱ期的去核卵母细胞透明带下,经电融合和离子霉素与6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活,直接移入同期发情奶山羊输卵管或经体内培养,将发育的重构胚移人同期发情羊子宫内.妊娠早期作B超诊断,确立妊娠的观察至足月.同时将奶山羊的35日龄胎儿成纤维细胞作供核细胞(对照组),按试验组同样方法处理,将重构胚直接移入同期发情的奶山羊输卵管内.结果试验组,波尔羊颗粒粒细胞与耳皮肤成纤维细胞的融合率分别为78.2%(115/147)、57.4%(116/202),重构胚卵裂率为85.8%(115/134),桑椹胚、囊胚的发育率38.8%(52/134),早期妊娠三头,分别于妊娠40、60、60日龄终止妊娠.对照组,融合率为89.5%(136/152),早期妊娠率为42.9%(6/14),四头受体足月分娩,产四头公羊羔,其中三头存活,一头分娩时死于肺不扩张,并体重过大,显示胎儿过大综合症.经基因型鉴定证实,这四头克隆羔羊均源于同一胎儿成纤维细胞系.以上结果表明,波尔羊体细胞核在奶山羊卵母细胞中能够去分化,并维持一定程度的发育.     

奶牛卵泡超数同步发育及其卵母细胞的发育潜能

目的建立促奶牛卵泡超数同步发育的方法,并利用体细胞核移植和分子技术评价来自这些卵泡的卵母细胞发育潜能。方法用E2-P4对淘汰的高产奶牛进行联合处理后,分别对其实施不同组合的外源促性腺激素处理[FSH12h组,FSH48h组,FSH48h-LH6h组（简称LH6h组）,FSH48h-LH26h组（简称LH26h组）]以促进其卵泡超数同步发育;然后从卵泡中回收COCs进行体外成熟,排放第一极体的卵供作优质种牛的体细胞核转移（nucleartransfer,NT）受体,以评价卵的发育潜能。结果E2-P4能成功地诱导奶牛卵巢中产生一个新的卵泡起始波,并能保证卵泡在外源促性腺激素作用下实现超数同步发育;上述四组不同组合外源促性腺激素处理的卵母细胞衍生的NT重构胚经体内培养7d后,后3组的囊胚发育率显著高于FSH12h组和对照组（P〈0.01）;将这些克隆囊胚移植同步发情的受体牛子宫后,仅LH26h组的卵所获得的克隆胚能实现全程发育（直至克隆小牛出生）。经RT-PCR分析颗粒细胞中FSHr、LHr和连接蛋白43（Connexin43,Cx43）等mRNA含量变化,以及Western印迹分析其Bcl-2和Bax蛋白表达水平的变化,证实该组卵巢提供的同步发育卵泡为早期闭锁卵泡。结论E2-P4-FSH48h-LH26h组合处理可人为调控牛卵泡的同步发育;处于早期闭锁状态卵泡的卵母细胞具备较高的发育潜能。     

乳腺特异高表达人促红细胞生成素转基因奶山羊的制备

目的制备乳腺特异性高表达人促红细胞生成素（hEPO）转基因奶山羊。方法采用牛β-乳球蛋白基因（BLG）调控元件和hEPO全长编码序列基因组DNA构建真核表达载体,应用受精卵原核注射的方法制备hEPO转基因山羊。结果在原核注射获得的188头羔羊中,经Southern blot法检测有4头羊含有hEPO基因,其中3头为母羊,1头公羊于出生后20d死亡;3头转基因母羊hEPO基因的拷贝数分别为1、10、2;Western blot检测结果显示转基因羊乳中的hEPO分子质量为32kDa;MTT法检测结果表明,在泌乳10d的3只转基因羊乳汁中,每毫升乳汁中hEPO活性分别达到1.17×10^2IU、1.90×10^4IU、1.91×10^4IU。结论牛BLG能够调控hEPO基因在山羊乳腺中高表达,为实现其他药用蛋白在山羊乳腺中表达奠定了基础。     

外源激素组合控制青春期前奶山羊卵泡超数同步发育及其卵母细胞发育潜能的评价

本研究的目的是探索自青春期前奶山羊获取大量可用于体细胞核移植的卵母细胞的可能性。为此,本研究比较了几种不同组合的激素处理方法(对照、FSH、E2-P4和E2-P4-FSH)对出生39-60日龄的奶山羊卵巢大小、卵泡数量和卵泡大小的影响:同时将出生39-120日龄奶山羊按年龄分成三组来研究年龄对激素处理时招募起始生长卵泡数量的影响:然后,比较了来自E2-P4- FSH和FSH处理的早青春期前奶山羊卵巢上直径大于3mm卵泡中卵母细胞减数分裂能力;最后,通过SCNT方法验证E2-P4-FSH处理的早青春期前奶山羊卵巢上直径大于3mm卵泡中卵母细胞的发育能力。在四组激素处理的早青春期前奶山羊中,E2-P4-FSH处理组的卵巢最大、卵泡(直径大于3 mm)数量最多。在不同的年龄组中,39-60天组奶山羊卵巢上直径大于3mm的卵泡数量显著多于61-90天和91-120天组的。卵母细胞减数分裂能力的分析结果表明,来自E2-P4-FSH处理组的卵母细胞减数分裂能力显著高于FSH处理组的卵母细胞。与E2-P4-FSH处理后的成年奶山羊卵母细胞相比,早青春期前奶山羊卵母细胞发育能力较低:卵母细胞成熟后,作为受体用于体细胞核移植后的克隆囊胚发育率低于成年奶山羊(15.3%versus 22.1%,P<0.01)。然而,早青春期前的奶山羊经E2-P4-FSH处理后,自每头羊卵巢上直径大于3mm的卵泡数显著高于成年奶山羊(108±10.3 versus 28±5.0),因此,每头早青春期前奶山羊产生的克隆囊胚绝对数量显著高于成年奶山羊(7.1±2.7 versus 4.2±1.4)。由此,从本研究可以得出结论:E2-P4-FSH处理的早青春期前奶山羊能够为体细胞核移植研究提供相对多数量的具备一定发育能力的成熟卵。     

山羊M II期卵母细胞胞质支持异种间克隆胚的着床前发育

研究去核山羊(Capra hircus)体内成熟的M II期卵母细胞与异种成年的哺乳动物(包括山羊、波尔山羊、牛、塔尔羊、熊猫)及人的成纤维细胞融合形成的体细胞核移植胚胎着床前的发育能力。结果显示这些异种体细胞核移植重构胚可以完成着床前发育, 并形成囊胚。种内体细胞核移植胚的融合率和囊胚发育率分别为78.67%(557/708)和56.29%(264/469); 亚种间或种间体细胞核移植胚的融合率和囊胚发育率分别为: 波尔山羊78.18%(541/692)、33.90%(40/118), 牛70.53%(146/207)、22.52%(25/111), 塔尔羊53.51%(61/114)、5.26%(3/570), 熊猫79.82%(1159/1452)、8.35%(75/898), 人68.76%(317/461)、5.41%(16/296)。由此结果得出以下结论: (1)山羊M II期卵母细胞胞质与供核细胞之间的亲缘性不影响两者的融合率; (2)山羊M II期卵母细胞的胞质能支持异种间体细胞核移植胚的着床前发育; (3)亲缘关系近的种间核移植胚的囊胚发育率高于亲缘关系远的种间核移植胚的。     

继代核移植能成倍提高来自奶山羊卵胞质体的异种间核移植重构胚的发育率

为了提高异种间核移植重构胚的发育率,本研究以体内排放的奶山羊成熟卵为供胞质的受体细胞,以人、兔、波尔山羊等的异种或亚种体细胞的原代核移植（Primary Somatic Cell Nuclear Transfer,PSCNT）重构早胚（8-16细胞期）的卵裂球作供核体,观察经亚种或异种卵胞质体短期“修饰”的核再移植产生的继代（Secondary SCNT,SSCNT）重构胚的着床前发育潜能。结果：人、兔、波尔山羊的继代桑椹／囊胚发育率均显著地高于其PSCNT胚胎（人,14．81％VS．7．79％;兔,23．53％VS．12．50％;波尔羊,55．35％VS．24．53％）;这些早胚的各阶段发育时程仍遵循供核体动物正常受精卵的发育时程。结果启示：奶山羊成熟卵胞质对异种体细胞核亦具一定的去分化能力,能支持重构胚发育到囊胚;异种重构胚的发育特征是由供体核所决定的;继代核移植几乎能够成倍提高异种间重构胚的着床前发育率,提示核的去分化完全是在母型信息主导的调控之下完成的,而进一步发育的时序似乎是由核决定的：成倍延长在含母型信息主导调控环境中的时间能成倍提高SCNT重构胚的着床前发育率。     

利用Cre/LoxP系统删除转基因山羊体内的选择标记基因

在制备转基因家畜过程中的一个关键步骤是使用选择标记基因 (Selectable marker genes,SMGs) 将转基因整合细胞从大量的正常细胞中筛选出来,这导致了SMGs整合入家畜的基因组内持续传递给后代。SMGs已被证明能够显著影响基因组内整合位点处的基因调控,也增加了对转基因动物安全评价的复杂性。为了确定转基因山羊制备过程中SMGs的删除时机和删除方法,在体细胞克隆前后两个时段内,利用Cre/loxP系统删除SMGs的可行性,同时比较了蛋白转导和质粒共转染两种Cre导入方式的删除效率。结果表明：尽管在首次对山羊成纤维细胞进行遗传修饰后即可进行SMGs删除,但两次遗传修饰导致细胞严重老化,无法用于后续的体细胞克隆羊制备。在转基因山羊的成体细胞中删除SMGs不存在上述问题,成功率高,缺点是试验周期长、耗资增大。Cre表达质粒瞬时转染能够删除SMGs,但有超过30%的无SMGs细胞克隆中整合有质粒序列。TAT-CRE蛋白质转导方法可以避免引入的新外源基因,SMGs删除率达到43.9%~72.8%,是一种较佳的SMGs删除手段。     

山羊M II期卵母细胞胞质支持异种间克隆胚的着床前发育

研究去核山羊(Capra hircus)体内成熟的M II期卵母细胞与异种成年的哺乳动物(包括山羊、波尔山羊、牛、塔尔羊、熊猫)及人的成纤维细胞融合形成的体细胞核移植胚胎着床前的发育能力。结果显示这些异种体细胞核移植重构胚可以完成着床前发育, 并形成囊胚。种内体细胞核移植胚的融合率和囊胚发育率分别为78.67%(557/708)和56.29%(264/469); 亚种间或种间体细胞核移植胚的融合率和囊胚发育率分别为: 波尔山羊78.18%(541/692)、33.90%(40/118), 牛70.53%(146/207)、22.52%(25/111), 塔尔羊53.51%(61/114)、5.26%(3/570), 熊猫79.82%(1159/1452)、8.35%(75/898), 人68.76%(317/461)、5.41%(16/296)。由此结果得出以下结论: (1)山羊M II期卵母细胞胞质与供核细胞之间的亲缘性不影响两者的融合率; (2)山羊M II期卵母细胞的胞质能支持异种间体细胞核移植胚的着床前发育; (3)亲缘关系近的种间核移植胚的囊胚发育率高于亲缘关系远的种间核移植胚的。     

转溶菌酶基因山羊乳腺上皮细胞的原代培养及特性分析

采用组织块法、胰酶差速消化法分离了人溶菌酶(hLYZ)转基因山羊的乳腺上皮细胞,建立了转基因羊乳腺上皮细胞(TGMEC)的体外培养体系,并对其生长与体外分泌特性进行了分析.研究显示其体外生长曲线符合典型的S型,传代期间二倍体染色体数正常;通过免疫荧光染色、RT-PCR发现该细胞能表达上皮细胞所特有的角蛋白18,并能表达内源性乳蛋白(酪蛋白与乳球蛋白);进一步通过酶联免疫试验发现该乳腺上皮细胞在体外培养中可持续稳定地分泌重组人溶菌酶.由此获得的人溶菌酶转基因羊乳腺上皮细胞系为乳腺生物反应器研究提供了一个重要细胞膜型.