葡萄风信子花青素苷分析方法建立及成分鉴定

采用高效液相色谱(HPLC)技术,以葡萄风信子‘拉特夫拉姆’(Muscari latifolium)为材料,建立葡萄风信子花青素苷分析方法,研究了流动相配置、有机相初始及最高比例、流速等对葡萄风信子花青素苷洗脱效果的影响,并对该优化体系进行了可行性验证;采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术进一步对其成分进行结构鉴定。结果显示:(1)以0.1%甲酸水溶液-80%乙腈为流动相,梯度洗脱,流速0.8mL/min,Tosoh C18色谱柱柱温35℃为条件,可获得良好的洗脱效果。(2)在质量浓度为0.001~1mg/mL范围内线性良好,相关系数0.999 8;采用该技术方法对标准品矢车菊素的最低检出限为0.1μg/mL,加样回收率在94.4%~99.8%之间,相对标准偏差1.42%。(3)葡萄风信子花瓣中共鉴定出6种花青素苷,分别是飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷、锦葵素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-咖啡酰槐糖苷-5-O-阿拉伯糖苷、矢车菊素、矢车菊素-3-O-对香豆酰葡萄糖苷-5-O-丙二酰葡萄糖苷。     

矮牵牛编码F3′5′H的蓝色基因表达载体构建及转化

类黄酮3',5'羟基化酶(Flavonoid-3',5'hydroxylase,F3'5'H)是花色苷代谢途径中的一个关键酶,能使花色素合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素,从而使花色向蓝紫色偏移.本研究从蓝紫色矮牵牛(Petunia hybrida)花瓣中克隆了编码F3'5,H的蓝色基因Hf1,并通过PCR技术获得百合花特异表达启动子(PchsA),将百合PchsA与Hf1基因融合,构建了百合花特异表达启动子调控的Hf1基因植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化粉红色矮牵牛.抗性筛选和PCR检测鉴定转基因植株,结果表明,成功地获得了转基因阳性植株.     

蝴蝶兰F3′5′H基因转化OT杂种百合Robina的研究

为了定向育种获得蓝色百合,该研究以百合Robina为蓝色基因最佳受体,以其花丝诱导产生的胚性愈伤组织和再生小植株小鳞片作为转化材料,利用农杆菌介导法,将蝴蝶兰F3′5′H基因导入百合Robina中。结果表明:以小鳞片为转化材料,预培养3d,OD_(600)为0.8,侵染10min,共培养3d,加入100μmol/L AS稳定转化率最高为12.78%;而以胚性愈伤为转化材料,预培养2d,OD_(600)为0.8,侵染10min,共培养3d,加入100μmol/L AS稳定转化率最高为12.22%。2种转化材料的最适潮霉素筛选浓度均为20mg/L。对抗性植株分别进行PCR和反转录PCR检测,获得9个阳性株系,Southern印记分析进一步确定了6株转基因百合中携带蓝色基因F3′5′H,为后续进一步获得蓝色百合奠定了基础。     

矮牵牛编码 F3'5'H的蓝色基因表达载体构建及转化

类黄酮3',5'羟基化酶(Flavonoid-3',5'hydroxylase,F3'5'H)是花色苷代谢途径中的一个关键酶,能使花色素合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素,从而使花色向蓝紫色偏移.本研究从蓝紫色矮牵牛(Petunia hybrida)花瓣中克隆了编码F3'5,H的蓝色基因Hf1,并通过PCR技术获得百合花特异表达启动子(PchsA),将百合PchsA与Hf1基因融合,构建了百合花特异表达启动子调控的Hf1基因植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化粉红色矮牵牛.抗性筛选和PCR检测鉴定转基因植株,结果表明,成功地获得了转基因阳性植株.     

葡萄风信子MaGT1基因的克隆及其表达分析

该研究以葡萄风信子(Muscari ameniacum)‘亚美尼亚’为试材,克隆了花青素合成途径过程中的类黄酮糖基转移酶基因MaGT1(GenBank登录号MK652470)。该基因开放阅读框全长1 338 bp,编码445个氨基酸,预测蛋白分子量为49.301 kD,理论等电点为5.40。结构分析显示,MaGT1蛋白具有PSPG保守结构域、UDP 糖基转移酶家族结构域和UDP 葡萄糖醛酸基/葡萄糖基转移酶保守域(UDPGT)。进化分析表明,MaGT1蛋白与油棕、海枣、葡萄亲缘关系相近,聚类于类黄酮糖苷糖基转移酶类分支,以UDP 葡萄糖/鼠李糖为主要糖供体。花青苷含量测定显示,花青苷仅在葡萄风信子着色的花中积累,在根、鳞茎和叶以及未着色的花蕾(S1)中几乎检测不到花青苷,且随着花的发育,花青苷含量不断增加,并在衰败期(S5)达到最高。荧光定量PCR分析表明,MaGT1基因的表达具有显著的时空特异性,并在花中优势表达,而在根、鳞茎和叶片中微量表达;在花发育不同阶段,MaGT1基因的表达量随着花发育不断增加,并在盛花期达到峰值。研究表明,MaGT1蛋白催化反应是花青素合成途径中的重要修饰步骤。该研究结果为进一步分析MaGT1基因在葡萄风信子花青素合成和调控中的功能提供了依据。     

葡萄风信子MaFLS基因克隆与表达分析

该研究利用PCR技术从葡萄风信子‘亚美尼亚’中克隆了1个黄酮醇合成酶(FLS)基因,命名为MaFLS。MaFLS的cDNA全长为1 076bp,开放阅读框为999bp,编码332个氨基酸,推测的蛋白质分子量38.51kD,理论等电点为5.09。同源比对和系统进化分析表明,MaFLS基因编码的氨基酸具有黄酮醇合成酶典型的2-ODD超家族保守结构域,与拟南芥和高粱FLS一致性分别为60%和83%。半定量PCR和荧光实时定量PCR表达分析表明,MaFLS在花器官中高表达,在根、茎、叶中微量表达,在完全未着色的花蕾期开始表达并于花完全开放未着色时期到达峰值,之后随花发育表达量逐渐降低。原核表达检测到1条大约38kD的外源蛋白,与预测的蛋白分子量相符。该研究结果为进一步探讨葡萄风信子MaFLS基因对黄酮类物质合成的调控作用奠定了基础。