LfMADS1基因对新铁炮百合‘Raizen No.1’的遗传转化

为了获得无花粉、重瓣百合新种质,以新铁炮百合‘Raizen No.1’的离体小鳞片为受体,探讨了不同水平的抗生素和抑菌素对小鳞片再生能力的影响;利用正交试验对预培养时间、菌液浓度、侵染时间和共培养时间等4个因素的不同水平进行了筛选,优化了遗传转化体系;进行了百合花器官特性基因LfMADS1的转化,并对转基因植株进行了分子生物学检测。结果表明,新铁炮百合小鳞片选择培养时抗生素卡那霉素(Kan)浓度为100 mg/L,抑菌素为羧苄青霉素(Carb)浓度为500 mg/L。正交试验结果表明共培养时间是遗传体系中的主要影响因子;小鳞片转化的最佳条件是预培养1 d、侵染10 min、共培养5 d、菌液OD600值0.8。PCR检测的结果,得到4株转LfMADS1反义基因的新铁炮百合株系,其中1株已通过PCR-Southern检测。     

百合鳞片的诱导分化及遗传转化效率分析

基因工程是改良百合性状的重要手段,建立高效稳定的遗传转化体系是百合转基因研究的基础。以百合地下茎鳞片为外植体,筛选并优化百合的直接和间接再生体系;把含枸杞GR(Glutathione reductase)基因和筛选基因NPTII的载体,利用农杆菌转化法对鳞片和愈伤组织进行转基因操作,采用正交试验,优化转化条件以建立适合不同受体的遗传转化体系。结果表明,各阶段最优培养条件分别为:鳞片诱导和膨大MS+2mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+0.1mg/L NAA(萘乙酸)+ 90g/L蔗糖;鳞片直接分化MS+1.0mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.2mg/L NAA+ 30g/L蔗糖,间接分化MS+2.5mg/L 2,4-D +0.4mg/L TDZ(噻重氮苯基脲)+60g/L蔗糖;百合鳞片的Kana(卡那霉素)选择压为100mg/L,愈伤组织75mg/L。遗传转化体系条件为:鳞片,农杆菌OD₆₀₀=0.6,预培养3d,侵染40min,As(乙酰丁香酮)200μmol/L,阳性植株转化率为17.50%;鳞片分化愈伤组织,农杆菌OD₆₀₀,预培养5d,侵染40min,As 200μmol/L,阳性植株转化率为12.60%。     

大豆胚尖遗传转化体系优化及抗逆基因GmPK转化研究

采用GUS基因瞬时表达检测方法,通过正交试验以AS浓度、侵染菌液OD值、侵染时间、共培养时间和恢复培养时间5个因素在4个水平上进行分析,优化了农杆菌介导的大豆胚尖遗传转化体系,并在此基础上进行了抗逆基因GmPK的遗传转化。结果表明,采用共培养培养基中添加100μmol/L AS、侵染菌液OD600值0.9、侵染15h、共培养5d和恢复培养3d的转化条件最佳,GUS阳性率达74.59%,经PCR及RT-PCR进一步验证获得了转基因阳性植株。利用优化的最佳条件进行抗逆基因GmPK的转化,炼苗移栽成活的再生植株经PCR及PCR-Southern blotting验证,初步证明外源基因已经整合至大豆基因组,转化率为0.6%。     

根癌农杆菌介导麝香百合遗传转化体系的建立

以麝香百合"white elegance"叶片为外植体,通过根癌农杆菌介导法,研究了影响其转化的因素,建立了稳定而高效的麝香百合遗传转化体系。结果表明,以叶片为受体材料,外植体预培养有利于农杆菌的侵染;3 d的共培养,根癌农杆菌OD600值为0.6左右、侵染10 min,能获得较高的转化率;50 mg.L-1的卡那霉素对叶片有很好的筛选效果。抗性植株经PCR检测,初步证明Mn-SOD基因已转入到麝香百合植株中。     

农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LycB转化水稻的研究

以3个水稻品种的成熟胚诱导的良好胚性愈伤组织为受体,以LycB为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对水稻进行遗传转化,同时以抗性愈伤率为依据,对影响转化的几个因素进行优化研究。结果表明：预培养4d、侵染5～10min、农杆菌菌液浓度OD600值0.7～1.0、共培养2d有利于提高转化率。经潮霉素筛选获得的抗性植株经PCR和PCR-Southern分析鉴定,初步证明外源基因LycB已整合到水稻的基因组中。     

农杆菌介导韭菜遗传转化相关因素的研究

以"汉中冬韭"韭菜品种为试验材料,用含有pCAMBIA3301质粒的根癌农杆菌菌株EHA105对影响韭菜遗传转化效率的多种因素进行研究。结果表明,诱导40 d的愈伤组织,GUS基因瞬时表达率达到93%,且最适宜于不定芽的分化;当乙酰丁香酮(AS)的浓度为100μmol/L时,愈伤的GUS表达率达到91%,植株再生率为7.9%,AS浓度增加时其值也不会增加;菌液OD600值为0.6侵染10 min时,与其他组合相比,外植体受伤程度小,GUS表达率及再生率最高;侵染后的愈伤共培养3 d后,农杆菌生长较少,GUS表达率为91.1%,而再生率达到7.2%,为最佳的共培养时间。通过试验得到韭菜遗传转化因素的最佳条件,为今后的遗传转化提供一些参考。     

农杆菌介导的蓖麻转化体系优化

针对影响农杆菌侵染效率的主要因素进行条件优化,确立了以OD600为0.8的菌液侵染、预培养5 d后的外植体为最佳侵染条件;侵染外植体经过5 d的共培养并除菌后,转到含有250 mg/L Kan的培养基中进行再生诱导,获得了多株具有Kan抗性的再生植株;通过在共培培养基中添加20 mg/L AS,124 mg/L Na2S2O3和152.4 mg/L DTT,有效地抑制了侵染后外植体的褐化现象,提高了筛选阶段抗性芽的成活率;对具有Kan抗性的再生植株进行PCR和Southern blot验证,共获得18株包含外源基因的阳性转化株。     

根癌农杆菌介导甘蔗遗传转化Bt(cry1Ab)基因北大核心CSCD

以自育甘蔗品种"川蔗23号"诱导的胚性愈伤为受体材料,首次用较低的根癌农杆菌侵染浓度(OD600=0.1左右)与较短的侵染时间(1.5 min)成功实现甘蔗遗传转化Bt(cry1Ab)基因。结果表明,胚性愈伤分化与小芽生根最适潮霉素筛选浓度分别为20 mg/L和30 mg/L;愈伤组织胚性的一致性是影响筛选阶段愈伤再生的重要因素,培养40 d的愈伤组织为转化最适受体;转化材料经连续的潮霉素抗性筛选后,获得65株抗性植株,通过特异性引物的PCR扩增检测,有2株获得阳性条带,初步表明目的基因已整合到甘蔗染色体基因组中。     

农杆菌介导GUS基因对多年生黑麦草转化的研究

通过检测愈伤组织中GUS基因的瞬间表达,研究农杆菌LBA4404/pCAMBIA1301介导多年生黑麦草的转化体系。通过对多年生黑麦草瞬间表达率的比较,确立了其遗传转化的最佳优化条件。研究发现,多年生黑麦草不同品种的转化率在25%~45%之间变化。多年生黑麦草遗传转化最佳优化条件是预培养10d的胚性愈伤组织、浓度为0.5~0.8OD的农杆菌菌液以及2d共培养时间。在共培养基中添加100μmol/L乙酰丁香酮能有效地提高植物瞬间表达率。两种侵染处理方法比较结果为滤纸滴加法比浸泡法更优。转化后对愈伤组织的干燥处理能抑制农杆菌过度繁殖,能改善愈伤状态,有利于提高转化率。     

影响根癌农杆菌介导甜瓜转化NP-1基因的外部因子研究

以新疆伽师、皇后两个甜瓜品种的子叶切块与农杆菌共培养,将NP-1基因导入甜瓜。以再生植株的PCR检测阳性和卡那霉素抗性作为转化植株的初步判定。研究了甜瓜转化的外部因子：甜瓜子叶外植体经3d预培养,重悬于MS液体培养基使菌液浓度达OD600为0．6后进行侵染8～12min,再经3d共培养对转化最为有利;在侵染前进行0．2mg／L甘露醇高渗处理可提高转化率6．6％,乙酰丁香酮在甜瓜的转化中并未有显著影响。转化中卡那霉素合适筛选压力为100mg／L,转化后抑菌氨苄青霉素浓度为500mg／L有利于获取转化植株,转化率可达到12％。     

伪狂犬病毒gD基因转化马铃薯的初步研究

以可直接饲用的马铃薯作为伪狂犬病病毒糖蛋白基因gD的表达植物,探索用马铃薯茎段作为外植体的再生体系和遗传转化体系.结果表明:添加2 mg/L ZT和0.1 mg/L NAA的MS培养基,可使马铃薯茎段愈伤组织诱导率达70%,出芽率达38%;添加0.5 mg/L的硝酸银可明显减少愈伤组织在继代过程中的褐化程度,并且促进其分化.在农杆菌的菌液OD_(600)值为0.1～0.2,侵染茎段1 h,共培养3 d的条件下转化效果最好,抗性愈伤率达到52.3%.实验共获得21株转化植株,挑选7株进行RT-PCR检测,结果证明gD基因已被整合到马铃薯基因组中.     

罗汉果转抗病基因NPR1的研究

以罗汉果子叶为外植体,研究了影响根癌农杆菌介导的罗汉果遗传转化的若干因素,建立了罗汉果遗传转化体系.结果表明,5 d苗龄的子叶、预培养1 d、侵染20 min、共培养4 d、共培养温度22℃、AS100μmol/L、Hy浓度不定芽筛选为10 mg/L,生根筛选为20 mg/L转化率最高.抗性苗经PCR和Southern...     

苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞及转基因植株再生的研究

以葡萄的胚性愈伤组织作为农杆菌介导,Ti质粒转化材料,利用共培养法将苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞,通过胚状体发生途径再生转基因植株。实验发现:80μmol/L的乙酰丁香酮诱导处理农杆菌和葡萄愈伤组织后可将转化效率提高50倍。OD值为0.8的农杆菌菌液稀释8—10信后与在G培养基预培养10天的胚性愈伤组织共培养2—3夭,Ti质粒对葡萄愈伤组织细胞的转化效率可达50%左右。筛选得到的转基因植株在含Km 30 mg/L的选择培养基上继代存活6个月,生长正常;提取叶片染色体DNA做Southern blot,杂交结果为阳性。将转基因植株各部分切段置于含Km 50 mg/L的选择培养基上,能够脱分化产生抗性愈伤组织并能增殖。     

兰州百合基因枪转化方法的研究

以兰州百合试管苗鳞片叶为受体,通过基因枪转化法将脱氢抗坏血酸还原酶基因(DHAR)转入兰州百合,并用GUS染色、PCR扩增和Southern杂交等技术进行转基因株系的检测.结果表明:以兰州百合鳞片叶为受体材料,在轰击压力1 100 psi、轰击距离6 cm时,抗性率高达14%,转化率为1.5%;10 mg/L的潮霉素对鳞片叶具有很好筛选作用.GUS分析发现,转化株系叶片为蓝色;PCR检测和Southern杂交进一步证实抗性株系为转基因植株,且为单拷贝.     

根癌农杆菌介导的金发草遗传转化条件的优化

金发草(Pogonatherum paniceum)是一种多年生岩生草本植物,在生态恢复和景观建设中起着重要的作用。利用根癌农杆菌介导转化金发草胚性愈伤组织,通过GUS(β-葡萄糖苷酸酶)瞬时表达率研究菌液浓度、浸染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度、葡萄糖浓度、共培养时间等因素对金发草转化的影响,并利用确定的最佳条件将GUS基因转入金发草,获得稳定表达转化植株。结果表明:菌液浓度(OD₆₀₀)为0.6,浸染时间为10min,添加20mg/L的乙酰丁香酮(AS)和10g/L的葡萄糖,共培养时间5d为最佳条件,GUS瞬时表达率最高。经过抗性筛选后最终获得阳性转基因植株频率为57%。再生植株经GUS染色和PCR检测证明,GUS基因已成功整合到金发草基因组中。此转化体系的建立为金发草的遗传改良及相关功能基因的研究奠定了基础。     

优良大麦品种花30幼胚遗传转化体系的优化

以大麦花培基因型花30的幼胚为外植体,设置不同的培养基类型、不同激素配比及碳源,研究其对幼胚愈伤组织诱导及绿苗分化的影响,以此建立和优化一个适于优良大麦品种遗传转化的高效组织培养体系。结果表明:在N6、MS和B5的组合改良培养基下,以蔗糖为碳源,附加2mg/L 2,4-D、1mg/L ABA时,有最高的愈伤组织诱导率,且愈伤质量最好。Cu2+的添加具有抑制幼胚直接发芽成苗和改善愈伤组织质量的双重功效。添加2mg/L 6-BA对愈伤组织的分化效果比较理想。为了提高农杆菌介导转化大麦外源基因的瞬时表达率和优化遗传转化体系,利用花30幼胚产生的愈伤组织为受体材料,通过检测GUS基因的瞬时表达情况,研究了农杆菌介导的大麦遗传转化中菌液的浓度、侵染时间以及共培养天数对遗传转化的影响,结果表明:当菌液浓度OD600=0.5的条件下,侵染15min,共培养2d表现出最佳的GUS瞬时表达率。     

农杆菌介导亚洲百合转化体系的建立及转GsZFP1基因研究

以亚洲百合‘耀眼’(Cedeazzle)无菌苗小鳞片为遗传转化受体,并利用农杆菌介导法将锌指转录因子基因GsZFP1转化‘耀眼’无菌苗小鳞片,初步建立亚洲百合‘耀眼’的遗传转化体系,通过筛选获得了50株疑似转化植株,通过用PCR方法对获得的50株疑似抗性植株进行检测,结果显示20株呈阳性,PCR阳性转化率为40%;将得到的阳性植株进行RT-PCR检测,获得12株RT-PCR阳性植株。结果表明,锌指转录因子基因GsZFP1在亚洲百合‘耀眼’中得到表达。     

PSAG12-ipt嵌合基因转化马铃薯体系的研究

以根癌农杆菌介导法将PSAG12-ipt嵌合基因导入马铃薯栽培品种,对影响马铃薯遗传转化的多种因素进行系统研究.结果表明:马铃薯茎段分化效率高于叶片,马铃薯愈伤诱导和芽分化最适培养基为MS+6-BA 0.25mg/L+NAA 0.25mg/L+2,4-D 0.25mg/L,添加1%Na2SO3能有效防止褐化;茎段愈伤诱导和分化苗生根最适的Kan浓度分别为50mg/L和75mg/L;外植体预培养2d,OD600为0.2～0.5的农杆菌浓度侵染8min、共培养3d后进行选择培养能有效地提高植株再生能力.用PSAG12和ipt双重PCR检测再生植株,阳性转化率为65.8%.Southern blotting结果表明,转基因植株多以单拷贝形式整合进马铃薯基因组中.     

EuFPS基因表达载体构建及对杜仲遗传转化的研究

本实验用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切植物表达载体pSH737和含有目的基因的pUC-FPS,定向连接得到重组质粒pSH-FPS,将其导入农杆菌EHA105.采用农杆菌介导法对杜仲进行遗传转化,研究了卡那霉素(kanamycin,Km)浓度、预培养时间、菌液浓度及侵染时间、乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)浓度、共培养时间等对杜仲遗传转化效率的影响.结果表明,选择无菌苗苗龄15 d的杜仲下胚轴,卡那霉素浓度50mg/L,农杆菌浓度OD600值0.3-0.6,侵染时间8 min,侵染时菌体重悬液中添加50 μmol/L乙酰丁香酮,共培养时间3 d,抗性芽的获得率最高.对再生植株进行GUS检测发现有45%的植株呈阳性.     

新疆杨高效遗传转化系统的建立

选择新疆杨(Populus alba L.var．pyramidalis Bge．)为遗传转化受体材料,为建立根癌农杆菌介导新疆杨高效遗传转化系统,从预培养时间、侵染时间、共培养时间、添加乙酰丁香酮(AS)的时机、共培养培养基中添加乙酰丁香酮浓度、侵染菌液的制备方法、外植体继代方式等7个方面优化筛选。结果显示较合适的转化系统为：预培养8h,农杆菌菌液(OD600=0．4)侵染15min,共培养5d,侵染菌液的最优制备方法是液体培养活化农杆菌2次加离心收集菌体重悬,共培养培养基中添加乙酰丁香酮80μmol／L。新疆杨叶盘转化频率可达38．10％。