N-糖蛋白去糖基化酶（PNGase）的研究进展

N-糖蛋白去糖基化酶（PNGase）是一种广泛存在于真菌、植物、哺乳动物中的去糖基化酶，可以水解N-糖蛋白或 N-糖肽上天冬酰胺与寡糖链连接的化学键，并释放出完整的N-寡糖。PNGase在生物体内参与蛋白质降解、器官发育、个体生长等过程。人PNGase基因功能缺陷会导致先天性去糖基化障碍，小鼠PNGase缺陷会导致胚胎致死性，线虫PNGase缺陷使其寿命下降。本文对PNGase在不同物种的分布、蛋白质结构、酶学功能及生物学功能进行阐述，为PNGase的生理病理功能及致病机制的基础研究提供思路，为PNGase作为糖生物学工具酶或药物开发的创新应用研究奠定基础。     

枯草芽孢杆菌耐盐突变株proA基因克隆proBA基因渗透压调节功能研究

利用TaKaRa LA PCRTM试剂盒扩增枯草芽孢杆菌93151耐盐突变株proA基因的未知下游序列。根据测序结果,设计引物,克隆出发菌株和突变株全长proBA基因。将出发菌株和突变株的proBA基因分别转化大肠杆菌JM83（proBA\+-）,均能够与其功能互补。SDSPAGE分析其表达产物,有两条分子量分别约为40kD和45kD的新蛋白带出现。测定4种转化子（分别含有出发菌株和突变株proB基因的大肠杆菌1.1252转化子及proBA基因的大肠杆菌JM83转化子）的耐盐能力。发现含有突变株proB或proBA基因转化子的耐盐能力,均比相应的含有出发菌株proB或proBA基因的转化子高。另外含有出发菌株和突变株的proBA基因转化子的耐盐能力, 也均比相应的仅含proB基因的转化子高, 表明枯草芽孢杆菌的ProA比大肠杆菌的ProA更为有效。测定所有JM83转化子胞内自由脯氨酸,发现其含量随盐浓度的上升而提高,其中含突变菌株proBA基因的转化子提高更为显著。     

枯草芽孢杆菌渗透压调节基因proB的克隆和表达

用PCR扩增的方法从耐盐的枯草杆菌中克隆出一个13kb长的DNA片段,经功能检测,证明正向插入片段与大肠杆菌的脯氨酸营养缺陷特性(proB-)能够营养互补。含有该重组质粒的大肠杆菌DH5α在基本培养基上的耐盐能力从2%提高至4%。通过引物步行法测定了该插入片段的核苷酸序列。利用DNAsis软件进行序列分析发现,该片段第122～1235bp核苷酸编码一个由370个氨基酸组成的蛋白质分子,其上游存在非典型的-10区,典型的-35区和核糖体结合位点,起始密码子处有最佳翻译起始效率的侧翼核苷酸序列。将其与Genebank中的已知基因的序列和编码的氨基酸序列进行同源性比较,结果表明该片段与枯草杆菌168的核苷酸序列、氨基酸序列的同源性分别为81%和90%。证明该基因确实是一个proB基因。通过与三十个不同种属微芽生物proB基因的氨基酸序列比较,发现该蛋白存在有可能与形成酶的活性中心和三维结构有密切关系的几个绝对保守的区域。     

牙龈卟啉单胞菌血凝素2氯化血红素结合位点多肽对牙龈卟啉单胞菌生长抑制作用

目的探讨牙龈卟啉单胞菌血凝素2（Porphyromonas gingivalis hemagglutinin-2,PgHA-2）的氯化血红素结合位点多肽对牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis,Pg）摄取氯化血红素生长的影响。方法合成多肽DHYAVMISK（肽1）,DEYAVMISK（肽2,肽1中第2位氨基酸突变为谷氨酸）,ALHPDHYLI（肽3,HA-2结合位点不相关多肽）。将肽l、肽2、肽3分别与氯化血红素琼脂糖珠预孵育,加入Pg重组血凝素2（Porphyromonas gingivalis recombinant HA-2,PgrHA-2）,收集与氯化血红素结合的PgrHA-2,SDS—PAGE电泳,分析多肽对PgrHA-2与氯化血红素结合的抑制作用。肽1、肽2、肽3与氯化血红素预孵育后,加入到CDC液体培养基中培养Pg,测定菌液A600值,分析多肽对Pg生长的抑制作用。结果肽1浓度依赖性抑制PgrHA-2与氯化血红素结合,而肽2和肽3对PgrHA-2与氯化血红素的结合无抑制作用。在24、48和72h时间点,肽1组的A600值较肽2、肽3和PBS组明显降低（P〈0．05）。结论本研究表明PgHA-2氯化血红素结合位点多肽DHYAVMISK与Pg竞争结合氯化血红素,抑制Pg的生长,为开发新的牙周病防治方法奠定基础。     

渗透压调节基因proBA的融合表达对大肠杆菌耐高渗胁迫能力的影响

枯草芽孢杆菌 9315 1的渗透压调节基因proB和proA以重叠基因的方式组织 ,但是表达两个单独的蛋白质ProB和ProA。通过引物设计 ,在抗脯氨酸反馈抑制耐盐突变菌株 9315 1 14的proBA基因重叠区引入一个限制性酶切位点 ,分别扩增出proB和proA基因 ,并构建融合的proBA基因。SDS PAGE分析显示有一条新的分子质量约为85kD的蛋白带出现。相对于表达未融合的proB和proA ,proBA融合基因的表达明显提高了宿主菌大肠杆菌JM83胞内游离脯氨酸含量和其耐高渗胁迫能力     

细菌视紫红质 E204Q 和 I119T/T121S/A126T突变体的构建及其功能研究

应用定点突变的方法获得了细菌视紫红质 (bacteriorhodopsin , BR) 的单突变体 BR_E204Q和三突变体 BR_{I119T/T121S/A126T}. 通过功能研究发现, BR 蛋白的单突变体 BR_E204Q的 M 态寿命为 7.10 ms ,三突变体 BR_{I119T/T121S/A126T}的 M 态寿命为 8.23 ms ,均较野生型 BR 蛋白 (6.23ms) 有所延长,三突变体表现得更为显著,其 M 态延长时间可超出野生型的 32％. 同时单突变体 BR_E204Q和三突变体 BR_{I119T/T121S/A126T}的质子泵功能也均有改变,都比野生型 BR 蛋白有所下降,其中三突变体 BR_{I119T/T121S/A126T}下降得更为明显.     

糖基转移酶和去糖基化酶

在糖基化工程中,通过酶法对蛋白质进行糖基化修饰和对天然糖蛋白去糖基化是研究糖蛋白结构与功能的重要手段。本文综述了近年来所纯化的主要的糖基化转移酶和去糖基化酶的性质和应用。     

生物技术专业建设的实践与探索

生物技术是一门涉及领域宽、涵盖范围广、基础性强的新兴生物学科,是现代生物学发展并与相关学科交叉融合的产物。生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、发酵工程等领域,其核心是以DNA重组技术为中心的基因工程。生物技术产业是世界各国在21世纪优先发展的支柱产业,它对不断提高人类的生活质量,与严     

枯草芽孢杆菌抗脯氨酸结构类似物突变株的筛选及突变株proBA基因的克隆和序列分析

利用亚硝基胍对枯草芽孢杆菌93151进行诱变处理,获得了耐NaCl浓度达14％的突变株,同时发现该突变株也是一个抗脯氨酸反馈抑制突变菌株,其胞内自由脯氨酸的含量随着盐浓度的提高显著增加,说明其对渗透压的耐受能力与胞内自由脯氨酸的含量紧密相关。利用PCR方法克隆突变株的proBA基因,得到一个约2.3kb的DNA片段,序列分析表明该片段含有一完整的proB基因和部分proA基因,与野生菌株的proB基因相比,突变株proB基因中有3个碱基发生了改变,其中一个碱基的变化（从起始密码子开始第781位由T→A）导致了一个氨基酸发生改变（Ser→Thr),另外两个碱基变化为沉默位点突变。将该proB基因转入大肠杆菌脯氨酸营养缺陷型菌株,能够与其功能互补。同时对部分proA基因序列分析发现,其与proB基因头尾重叠。在proA基因起始密码子上游第14个碱基处有一个类似于SD的序列,其所编码的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌168的同源性为77％。     

DR-70~(TM)和CA50肺癌免疫测定的应用价值

目的 :评价DR 70 TM和CA5 0两种肿瘤标志物在肺癌检测中的价值。方法 :应用DR 70 TMELISA和CA5 0IRMA对77例肺癌患者 ,42例健康者及 48例其它肺癌者进行对照检测。结果 :各组DR 70 TMCA5 0测定值比例显示肺癌组平均值显著其它两组 (P <0 .0 1)。DR 70 TM检测的敏感性和有效性高于CA5 0检测 (83.1%比 6 6 .2 % ,85 .7%比 75 .6 % )。两项联合检测的敏感性 ,有效性分别为 96 .1% ,93.1% ,优于单项DR 70 TM 检测的 83.1% ,85 .7% ,及CA5 0的 6 6 .2 9%、75 .6 %。结论 :DR 70 TM在肺癌检测中有较大应用价值。DR 70 TM 和CA5 0两项联合检测是较理想的肺癌检测组合