腹腔一次注射法构建百草枯致小鼠肺间质纤维化模型

目的建立一种简便易行的百草枯(PQ)致肺间质纤维化动物模型。方法 33只C57BL/6J小鼠随机分为实验组(30只)和对照组(3只)。实验组腹腔一次性注射PQ 10 mg/kg,并于染毒后第2、5、7、14、28天处死小鼠,对照组腹腔注射生理盐水并于第28天处死。观察两组小鼠的一般情况、肺组织大体结构和肺组织病理学改变。结果实验组小鼠在染毒后2 h即出现中毒性改变,肺组织在第28天出现了明显的纤维化改变。结论腹腔一次性注射PQ能简便、可靠的构建出肺纤维化动物模型,可用于进一步研究PQ中毒所致的肺间质纤维化发病机制和治疗方法。     

动物微生态制剂猪肠源乳球菌的分离与鉴定

试验的菌种是从宁夏平罗县边远农村基本自然生长的健康肉猪的小肠、大肠和盲肠中分离获得的,共分离出64株菌株。通过对这64株菌株的菌落形态观察和革兰氏染色镜检。筛选出9株进行了乳球菌属的生理生化鉴定,初步确定这9株属于乳球菌属(Lactococcus)。再通过糖醇类发酵产酸鉴定,确定2株为乳酸乳球菌乳酸亚种(L.lactissubsplactis),3株为植物乳球菌(L.plantarum),4株为棉籽糖乳球菌(L.raffi-nolactis)。各项鉴定结果均符合乳球菌属和相应种鉴定标准。     

2010年内蒙古自治区手足口病病原谱及人肠道病毒71型分子特征研究

研究2010年中国内蒙古自治区引起手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)的病原谱及人肠道病毒71型(Human enterovirus,HEV71)的分子特征。采集内蒙古自治区12个盟市门诊就诊的HFMD患者粪便和咽拭子标本共921份,进行病毒分离,然后利用三通道实时荧光定量PCR法[同时检测HEV71,柯萨奇病毒A16型(CVA16)和人肠道病毒(HEV)]对阳性分离物进行鉴定,对鉴定为其它HEV的阳性分离物进行VP4和VP1编码区扩增及核苷酸序列测定和分析。921份标本共分离出153株病毒,阳性率为16.61%,其中61株为HEV71,占39.87%,82株为CVA16,占53.59%,7株为其它HEV(分别为6株CVB4和1株Ⅱ型脊髓灰质炎疫苗病毒株),占6.53%,3株为腺病毒。重症病例中分离到9株病毒,其中6株为HEV71,3株为CVA16。选取从临床诊断分别为普通型病例、重型病例的HFMD患者临床标本中分离到的32株HEV71代表株进行VP1编码区基因扩增及核苷酸序列测定和分析,与HEV71其它各基因型和基因亚型的代表株构建亲缘性进化树。32株内蒙古HEV71代表株与1998年以来中国大陆HEV71分离株的VP1区核苷酸和氨基酸水平上的同源性都较高,尤其与2008年的北京代表株同源性最高,与C4基因亚型代表株聚为一支,属于C4基因亚型C4a进化分支,但它们之间的核苷酸和氨基酸的同源性略有差异,分别为96.4%～100%和98.14%～100%,与2007年的内蒙古代表株存在一定的差异,核苷酸同源性为96.95%～97.87%。亲缘进化关系树显示,这些HEV71处于不同的簇中,属于多个病毒传播链。2010年内蒙古HFMD的病原谱以CVA16和HEV71为主,重症病例中以HEV71居多。内蒙古流行的HEV71属于C4基因亚型C4a进化分支,并且存在多个传播链,与2008年北京代表株亲缘关系比2007年内蒙古代表株亲缘关系近,说明内蒙古流行的HEV71不是独立进化的,而是与中国流行的HEV71在共同进化。     

表达马传染性贫血病毒受体和荧光素酶报告基因的293细胞系的建立

为了在体外精确、简便地测定马传染性贫血病毒(EIAV)的中和抗体和研究不同毒株与受体的亲和性,克隆了马慢病毒受体1(ELR1)cDNA并插入真核表达载体pcDNA3.1( ),构建了表达载体pELR1。该载体瞬时转染293细胞后,经Western blot和间接免疫荧光(IFA)检测,确认了ELR1的表达。在pELR1质粒的基础上,插入EIAV疫苗株前病毒基因组转录调控区LTR以及萤火虫荧光素酶报告基因(Luc)构建了表达载体pELR1-LTR-Luc,并转染293细胞,建立了ELR1-LTR-Luc(293-E)细胞系。该细胞系能稳定表达ELR1基因,并且能在LTR的调控下表达萤火虫荧光素酶基因。用1000TCID50的EIAV驴胎皮肤细胞疫苗株D18V13接种该细胞,24h后检测其荧光素酶活性是未接毒对照的3.15倍。同时用IFA检测证明了病毒在细胞内的增殖。EIAV强毒株L21的接毒试验显示,ELR1-LTR(293-E)细胞的萤火虫荧光素酶活性与该毒株的接毒量在10-2~10-7稀释范围内呈正相关。该细胞系传35代后,外源基因的表达特征未发生改变。该细胞系的建立为进一步开展EIAV与细胞受体相互作用以及中和抗体评价等研究奠定了重要基础。     

绵羊肺腺瘤病毒pEGFP-C1/exJSRV-env构建及引起NIH3T3细胞恶性转化的研究

为了构建绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因真核表达质粒并观察绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在293T细胞中的定位情况以及探讨是否可诱导NIH3T3细胞发生恶性转化,本研究采用RT-PCR技术从自然感染绵羊肺腺瘤病的病羊肺组织中克隆完整的外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因(exJSRV-env),并将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1中。构建好真核表达质粒经PCR、酶切和测序鉴定。同时对exJSRV-env基因进行生物信息学分析。采用脂质体法将该重组质粒转染293T细胞,观察其在真核细胞中的表达及定位情况。将该重组质粒转染NIH3T3细胞,观察细胞是否发生恶性转化。用软琼脂集落实验检查转染重组质粒的NIH3T3细胞的生长状态。结果显示真核表达质粒构建成功并命名为pEGFP-C1/exJSRV-env。exJSRV囊膜蛋白的氨基酸序列与参考株比对发现该囊膜基因的跨膜区(TM区)的胞质尾区具有外源性病毒特有的YXXM基序。系统进化树也表明我们克隆的exJSRV-env基因属于致病性的外源性病毒。运用生物信息学技术分析env基因编码的蛋白质的基本性质,并预测其可能的结构。亚细胞定位表明exJSRV囊膜蛋白主要分布于细胞膜。转染pEGFP-C1/exJSRV-env质粒的NIH3T3细胞接触抑制性消失,可在软琼脂中形成集落。说明绵羊肺腺瘤病毒的囊膜蛋白可引起NIH3T3细胞发生恶性转化。研究结果为进一步探讨exJSRV囊膜蛋白的结构和功能及其致病机理提供了实验基础。     

绵羊肺腺瘤病毒内蒙古分离株前病毒全基因组克隆及序列分析北大核心CSCD

为了探究绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)内蒙古流行株与国际各代表株间的亲缘关系,本研究以内蒙古地区绵羊肺腺瘤病自然病例的肺组织总DNA为模板,克隆gag、pro与pol基因,并应用双酶切的方法将其与本实验室先期制备并保存的LTR、env基因连接起来,得到了含有JSRV内蒙古分离株前病毒全基因组重组质粒pMD-JSRV。序列分析结果表明,JSRV内蒙古分离株前病毒全基因组全长7 690bp,具外源性JSRV典型的分子特征:1在gag基因中含Sca I酶切位点;2核衣壳蛋白区有2个保守的可形成锌指结构的"CCHC"基序;3env基因编码的TM区胞浆尾部包含保守的特异性"YXXM"基序。将其进行同源性分析,结果表明该株病毒属JSRV-II型,与分离自美国的代表株AF105220间亲缘关系较近,同源性达95%。本研究为进一步探讨JSRV内蒙古分离株基因组结构特点与其致病机制间的关系奠定了基础。     

绵羊肺腺瘤病毒内蒙古分离株前病毒全基因组克隆及序列分析

为了探究绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)内蒙古流行株与国际各代表株间的亲缘关系,本研究以内蒙古地区绵羊肺腺瘤病自然病例的肺组织总DNA为模板,克隆gag、pro与pol基因,并应用双酶切的方法将其与本实验室先期制备并保存的LTR、env基因连接起来,得到了含有JSRV内蒙古分离株前病毒全基因组重组质粒pMD-JSRV。序列分析结果表明,JSRV内蒙古分离株前病毒全基因组全长7 690bp,具外源性JSRV典型的分子特征:1在gag基因中含Sca I酶切位点;2核衣壳蛋白区有2个保守的可形成锌指结构的"CCHC"基序;3env基因编码的TM区胞浆尾部包含保守的特异性"YXXM"基序。将其进行同源性分析,结果表明该株病毒属JSRV-II型,与分离自美国的代表株AF105220间亲缘关系较近,同源性达95%。本研究为进一步探讨JSRV内蒙古分离株基因组结构特点与其致病机制间的关系奠定了基础。     

绵羊肺腺瘤病毒中国NM株部分gag基因的克隆与序列分析

参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的基因序列,设计合成一对引物,对绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)内蒙株的gag基因中主要编码CA蛋白的基因段进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约897bp的特异条带,将其回收后克隆入pMD—18T载体中,并进行序列测定与分析。结果表明,与南非株(基因序列号NC—001494)的gag基囚序列比较,核苷酸同源性为83％,推导出的氨基酸同源性为84％。与美国株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为81．5％,氨基酸同源性为83％。这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的一段序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础。     

激光多普勒对糖尿病小鼠微循环自律运动功能的评估

目的:探讨激光多普勒对糖尿病小鼠微循环自律运动功能的评估价值。方法:20只BALB/c小鼠随机分为糖尿病组(n=10)和对照组(n=10)。连续5天腹腔注射40 mg/kg STZ诱导糖尿病模型;应用Moor LDLS检测糖尿病小鼠皮肤微循环血流灌注水平;应用Moor VMS-LDF检测糖尿病小鼠胰腺微循环血流灌注及微血管自律运动功能。结果:糖尿病小鼠皮肤微循环血流灌注显著降低,皮肤总血流灌注量(P=0.009)、胰腺微血管自律运动频率(P0.001)和振幅(P0.001)均显著低于对照组小鼠。结论:联合应用Moor LDLS激光多普勒扫描成像系统及Moor VMS-LDF激光多普勒血流灌注监测系统可作为糖尿病小鼠微循环功能状态的评估手段。     

Hippo信号通路生物学作用研究进展

Hippo信号通路是20世纪末在黑腹果蝇中进行基因筛选时发现的,该通路受各种生化、物理和结构信号的影响,调控细胞生长、分化,组织和器官发育以及内环境稳态等基本生物学过程。研究表明Hippo信号通路失调会引起一系列疾病的发生。本文阐述了目前Hippo信号通路在胚胎发育、器官和组织稳态调节、肿瘤的发生发展和细胞自噬等一系列生物学过程以及靶向治疗中的研究进展,其中Hippo信号通路通过细胞自噬来维持机体细胞内环境稳态成为新的研究热点。对该通路的功能和调控机制的深入研究也为组织器官修复再生医学及癌症治疗提供参考。