DDX21 RNA解旋酶不同结构域的功能特点解析

DEAD-box家族是在生物体内普遍存在的一类高度保守的RNA解旋酶,在RNA的合成和加工、细胞发育和细胞代谢等过程中都发挥着重要作用。DDX21 RNA解旋酶是DEAD-box家族成员之一,而目前为止DDX21的酶学功能及结构特征尚未被完全了解。本研究运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了DDX21各结构域在不同功能中发挥的作用。首先重组构建并纯化了人的DDX21 RNA解旋酶及不同的截短蛋白质,利用动态激光散射和凝胶层析技术分析各蛋白质的寡聚形态,发现N-端的非功能区（N-端181aa）与C-端的4个FRGQR重复结构域对其结构有较大的影响;利用荧光偏振技术比较分析了各蛋白质与单链RNA的结合反应,结果显示,仅保留DEADc和HELICc结构域的截短蛋白质与单链RNA完全没有亲和性,缺失N-端181aa的截短蛋白质对ssRNA的结合能力与全长蛋白质基本一致,而仅缺失C-端的4个重复FRGQR结构域的截短蛋白质与单链RNA的亲和能力将显著下降;利用快速停流检测技术分析各截短蛋白质的解旋及退火活性,发现DEADc、HELICc及GUCT_RHII三个结构域共同参与DDX21的解旋功能,另一方面,缺失C-端4个FRGQR重复结构域的截短蛋白质导致退火能力的丧失。本研究揭示了DDX21的GUCT_RHII结构域及C-端4个FRGQR重复结构域在其结构及功能中发挥的重要作用,为今后研究DDX21的结构及其细胞功能提供了重要的理论依据。     

柴胡多糖的结构和抗氧化活性分析

用超声波辅助提取法从柴胡中提取、分离得到多糖SAP3。高效液相色谱法测定其相对分子质量,红外光谱、气相色谱和原子力显微镜对其结构进行初步分析。结果表明:柴胡多糖SAP3是组分均一的多糖,由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成,平均相对分子质量为3.3×105。红外光谱分析表明:柴胡多糖具有一般多糖类物质的特征吸收峰,单糖残基以吡喃环的形式存在。原子力显微镜显示柴胡多糖糖链具有分支结构,并缠绕形成环状结构。在0.2~1.2 mg/mL的实验浓度范围内,随着多糖质量浓度的升高,柴胡多糖SAP3对.OH的清除率逐渐增大,最大清除率可达45.2%。     

嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶生物学活性的分子特征分析

已知Pif1解旋酶在维持基因组稳定性方面发挥重要作用,且不同生物Pif1解旋酶具有不同的生物学活性;然而迄今为止,嗜热细菌Pif1解旋酶的生物学活性分子特征的研究尚未见报道。本文运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶（Defe.Pif1）结合活性与解旋活性的分子特征。通过原核表达纯化系统,本研究获得纯度95%以上、无标签的Defe.Pif1蛋白。利用荧光偏振技术研究Defe.Pif1结合反应的底物特异性,揭示出Defe.Pif1优先结合ssDNA与G4 DNA,并对含3′-尾链的部分双链底物有较强亲和力,其结合反应底物特异性为：ssDNA > G4 DNA > 3′-ssDNA-dsDNA≈Y-structure > Other substrates。通过快速停留检测技术研究Defe.Pif1的解旋活性,明确其最适解旋温度为50℃,最佳反应溶液为10 mmol/L NaCl、3 mmol/L DTT、3 mmol/L MgCl2及1 mmol/L ATP;进一步的解旋动力学特征分析结果显示,Defe.Pif1可以高效解旋含G4结构的DNA底物,其解旋5′-G4 dsDNA底物时的解旋幅度超过90%,解旋速率也与其解旋5′-ss-dsDNA底物的速率相近,提示Defe.Pif1解旋G4 DNA更接近Bs.Pif1的单体反应模式。此外,本研究还发现Defe.Pif1解旋不同类型复制叉/复制泡底物时拥有独特的解旋倾向性：与解旋其它复制中间体DNA的低效性不同,Defe.Pif1解旋12nt bubble底物的速率与幅度均较高,暗示12nt bubble结构很可能是该解旋酶复制中间体的天然底物。上述结果证明,Defe.Pif1不仅具有Pif1解旋酶家族成员共同的结合与解旋G4 DNA等活性特征;而且作为嗜热细菌的解旋酶,它还具有独特的反应条件与解旋底物特异性。本研究为研究Pif1解旋酶家族其它成员的分子特征与生物功能提供了潜在的研究策略,为阐明此类Pif1解旋酶的分子作用机制奠定实验基础。     

SENP1启动子G-四链体鉴定及其作用研究 *

目的:研究G-四链体(G4)对SUMO特异性蛋白酶1(SUMO-specific proteases 1, SENP1)基因的转录调控作用。方法:克隆不同的SENP1启动子片段构建SENP1启动子报告质粒,通过报告基因检测鉴定SENP1启动子核心转录调控区;分析SENP1启动子核心转录调控区序列,并进行G4形成序列预测;合成G4形成序列寡核苷酸,利用圆二色谱分析检测G4形成序列寡核苷酸的拓扑结构;通过G4配体TMPyP4处理和过表达G4解旋酶G4R1结合报告基因检测和Western blot鉴定启动子G4对 SENP1转录表达的调控作用。结果:发现-910 ~+226区域是SENP1启动子的核心转录调控区,序列富含G/C;生信分析发现SENP1启动子核心区存在G4形成序列;圆二色谱分析证实SENP1启动子G4形成序列能够形成G4结构;报告基因检测和Western blot检测发现启动子G4对SENP1转录表达具有抑制作用。结论:SENP1启动子核心转录调控区存在G4结构并对其转录表达具有抑制作用,为揭示SENP1在生理和病理过程中的作用机制提供新的研究思路和试验线索。     

利用傅立叶红外光谱和原子力显微镜研究超声提取对鸡腿菇多糖结构的影响

利用沸水浴法和超声辅助提取法提取鸡腿菇粗多糖,分别得到对应的多糖水浴提取的多糖(WCP)和超声提取的多糖(UCP)。采用苯酚硫酸法测得WCP和UCP中的总糖质量分数分别为87.997%和72.937%。用季铵盐沉淀法和Sephadex G 200凝胶层析法对WCP和UCP进行分离纯化,得WCP3 1、UCP3 1 2个主要组分,用傅立叶红外光谱(FTIR)和原子力显微镜(AFM)对提取多糖的结构进行表征。结果显示:WCP3 1和UCP3 1均具有一般多糖类物质的特征吸收峰,WCP3 1和UCP3 1的单糖残基均以β吡喃环存在,但超声波可导致部分C O双键断裂形成C—O链接;WCP3 1呈现大量的近似螺旋聚集体和少量球状聚集体,但是UCP3 1是较小的分散球状聚集体,说明超声波可断裂多糖的分子链间或链内氢键,导致近似螺旋聚集体的降解。     

嗜热细菌Anaerobaculum hydrogeniforman Pif1解旋酶的异源表达与解旋反应特性

【目的】原核表达与纯化源自嗜热细菌Anaerobaculum hydrogeniforman的Pif1解旋酶,从而探究其解旋反应特性。【方法】将重组载体pET21a-AnaPif1-TEV/SUMO导入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并进行Ni-NTA亲和层析、Superdex200凝胶过滤层析等一系列纯化手段;再利用快速停留监测技术系统地研究Ana.Pif1的解旋反应特性,包括解旋极性、最佳ATP浓度、最佳金属辅因子、最佳解旋温度以及解旋复制中间体DNA的底物特异性。【结果】通过异源表达与纯化,获得了无任何标签序列、分子量59 kDa的Ana.Pif1蛋白,纯度达97%,产率为9.5 mg/L。本研究首先验证Ana.Pif1具有5'-3'的解旋极性,并发现其解旋反应最佳ATP浓度为2 mmol/L,其最佳二价金属辅因子为Mg~(2+),最适反应温度为55°C。解旋复制中间体的底物特异性显示,Y-S型复制叉的解旋速率最高,为0.127s~(–1);而12 nt-bubble底物的解旋幅度最大,达到78.8%;暗示这些底物可能是Ana.Pif1的天然底物。【结论】本文首次较为系统地分析了Ana.Pif1解旋酶的解旋反应特性,为阐明此类嗜热细菌Pif1解旋酶的分子作用机制奠定了基础。