红细胞生长刺激蛋白二硫键定位连接方式的测定

目的:建立红细胞生长刺激蛋白(ESP)的二硫键连接方式的测定方法。方法:先将红细胞生长刺激蛋白的糖链用糖苷酶切除,再分别对ESP和还原烷基化后ESP用胰蛋白酶进行酶切,然后用MALDI-TOF测得该蛋白质的肽质量指纹图谱,通过比较还原烷基化前后各肽质量指纹图谱,找到差异肽段的分子离子峰[M+H]+,通过比对该蛋白理论酶切肽的[M+H]+,确定二硫键的连接方式。结果:ESP有4个半胱氨酸,通过比较还原烷基化前后的肽质量指纹图谱定位二硫键的位置为Cys7-Cys161和Cys29-Cys33,与理论上的二硫键连接相符。结论:建立了酶切结合质谱法测定蛋白质二硫键定位的方法,为今后生物技术产品的二硫键连接方式的质量控制提供了有效的方法。     

SOX4能与p53蛋白发生相互作用

目的：研究SOX4和p53蛋白之间的相互作用。方法：应用GSTpull-down、免疫共沉淀实验验证相互作用。结果：GSTpulldown实验证实SOX4能结合GST-p53融合蛋白,但不能结合GST蛋白;免疫共沉淀实验也证明,SOX4与p53能在细胞内发生相互作用。结论：SOX4能与p53发生相互作用,为p53信号通路的研究提供了新的线索。     

精氨酸修饰成纤维细胞生长因子21及修饰后蛋白体内稳定性和糖代谢调节作用的研究

成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor21,FGF21)是2000年发现的一个不依赖胰岛素调节血糖的细胞因子,有望成为治疗糖尿病的候选药物.但是,野生型FGF21由于半衰期较短,在体内不稳定,从而影响其成药性.为提高FGF21的稳定性,本实验在FGF21的C端添加了2个精氨酸(arginine,Arg),命名为FGF21-2A,用Compute pI/Mw软件计算之后,等电点(isoelectric point,pI)从5.43上升到5.84,随后进行了蛋白质的表达、分离纯化、体内稳定性及糖代谢调节作用的研究.诱导表达后菌液的SDS-PAGE图经BandScan5.0分析后显示FGF21-2A的表达量相对于野生型FGF21提高了10.6%.家兔体内半衰期检测实验结果显示FGF21-2A的半衰期显著延长.GOD-POD法检测HepG2肝癌细胞葡萄糖吸收实验、糖尿病小鼠降血糖实验和肝糖原检测实验的结果证明,FGF21-2A的降糖效果得到了增强,并且持续时间相对于野生型FGF21显著延长.Real-time PCR结果发现,长期注射FGF21-2A显著提高了糖尿病小鼠肝脏内葡萄糖转运蛋白(GLUT)1和葡萄糖激酶(GK)mRNA的表达量,降低了葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)的mRNA表达量,表明FGF21-2A调节糖代谢的机制与野生型FGF21一致.综上所述,精氨酸修饰的FGF21其蛋白质稳定性提高,进而增加了对血糖的调控效果,有望成为新型糖尿病药物.     

基质辅助激光解吸附电离飞行时间串联质谱应用于液体培养细菌的鉴定

目前, 利用质谱直接鉴定细菌的方法基本是应用固体培养基获得的单克隆细菌, 该方法耗时较长. 因此建立基质辅助激光解吸附电离飞行时间串联质谱直接分析液体培养细菌, 通过正交实验, 以2, 5-二羟基苯甲酸(50 mg/mL, 50%乙腈-0.1%三氟乙酸)为基质获得最佳质谱图. 通过主成分分析能将不同种细菌区别开. 在混合培养时, 每种细菌的主要特征峰能在混合样品的质谱图中找到, 并且该方法灵敏度为1.8×10³. 结果表明, 该方法快速、灵敏, 可用于临床样本的快速辅助检测.     

快速筛选高水平稳定表达成纤维细胞生长因子-21真核细胞新株方法的建立

成纤维细胞生长因子-21（FGF-21）是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员,其研究已成为世界糖尿病研究的新热点,并有望成为治疗2型糖尿病的新型药物.然而,应用真核表达系统,更加快速、高效生产更接近天然状态的FGF-21蛋白并对其生物学功能进行的研究,至今尚未报道,因此建立高效稳定的FGF-21真核表达系统至关重要.本研究以FGF-21为目的基因,利用谷氨酰胺合成酶基因（GS）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）作为筛选标记,分别构建了单基因表达载体Pee124-FGF-21-Pee64-EGFP（Peedual）、Pee124-FGF-21-IRES-EGFP（PeeIRES）和双基因的真核表达载体Pee124-FGF-21-IRES-EGFP-Pee64-FGF-21(Peedual-IRES),分别转染CHO-K1SV细胞后,通过GS加压和流式细胞术（在488 nm波长的激发光下能检测到EGFP绿色荧光）双筛选系统快速有效获得了稳定高效表达目的蛋白的细胞系.应用SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测细胞系目的蛋白的表达及差异,并通过HepG-2细胞糖吸收模型进行蛋白活性检测.研究结果表明：两个筛选系统结合使用,更好更快地筛选到了稳定转染并高效表达目的蛋白的细胞系,而且与单基因的载体相比,双基因载体Peedual-IRES在操作条件一致的情况下,目的蛋白表达量显著提高且均具有生物活性.本研究建立了省时、高效的真核表达平台,为FGF-21在真核水平上的高表达提供了一个新的方法.立了省时、高效的真核表达平台,为FGF-21在真核水平上的高表达提供了一个新的方法.     

用亲和纯化方法筛选与gankyrin相互作用的蛋白质

目的：作为一个新发现的癌蛋白,gankyrin在肝癌细胞的发生和形成中发挥重要作用。筛选与gankyrin相互作用的蛋白质,从而进一步探讨gankyrin的作用机制。方法：采用亲和纯化技术及质谱鉴定筛选与gankyrin相互作用的蛋白质。结果：初步筛选出了6个与gankyrin发生相互作用的蛋白质,经与MSDB或NCBInr数据库比对,这6个蛋白质均是26S蛋白酶体的组成部分,其中proteasome（prosome,macropain）26S subunit,ATPase,4为已报道的蛋白质,证实结果的可靠性。结论：采用亲和纯化的方法可以有效地筛选出与gankyrin相互作用的蛋白质,为进一步研究gankyrin的作用机制及生物学功能奠定了基础。