一株嗜麦芽窄食单胞菌裂解性噬菌体的分离及生物学特性

【背景】嗜麦芽窄食单胞菌是一种广泛存在于医院和自然环境中的条件致病菌,其分离率与耐药率逐年增加。噬菌体是一类能特异性感染并杀灭细菌的病毒。【目的】分离一株新型嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体,为临床嗜麦芽窄食单胞菌感染及防控提供补充手段。【方法】以临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌为宿主菌,用点板法从医院污水中分离鉴定噬菌体;用双层平板法测定噬菌体效价及一步生长曲线等生物学特性;用透射电镜观察噬菌体形态;提取噬菌体基因组DNA进行全基因组测序,拼接噬菌体基因组并进行注释。【结果】分离到一株嗜麦芽窄食单胞菌裂解性噬菌体,命名为v B＿Sma S＿P11。该噬菌体感染宿主菌的潜伏期小于5 min,快速增殖60 min后达到平稳期,暴发量为100 PFU/cell。透射电镜观察该噬菌体为长尾噬菌体,具有典型的二十面体头和不可收缩的尾部。基因组测序结果表明,该噬菌体基因组全长44 600 bp,GC含量为63.7%,无抗生素耐受基因、毒力基因和t RNA,与NCBI数据库中所有已知嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体相比同源性很低。基因组注释显示该噬菌体含有66个开放阅读框(open reading frame,ORF),其...     

大鼠胰岛分离、培养条件的优化及miR-126表达的检测方法比较

目的:优化SD大鼠胰岛细胞的分离、纯化和培养方法与条件,为研究miR-126在Ⅱ型糖尿病中的作用机制提供活性与功能良好的胰岛细胞及miR-126表达的检测方法。方法:水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠,采用8 mL胶原酶Ⅴ(含DNaseⅠ100 U)逆行注射、原位消化后Hitopaque-1077梯度离心分离纯化SD大鼠胰岛细胞,从培养后的胰岛细胞中提取总RNA,分别用加尾法和茎环法进行miR-126的反转录,实时定量PCR(qPCR)检测miR-126的表达量。结果:用该方法可从每只SD大鼠中分离、纯化得到胰岛细胞372±45个,胰岛细胞纯度90%,胰岛细胞存活率95%;用加尾法和茎环法qPCR检测miR-126的Cp值分别为34.56±2.56和32.47±2.01。结论:胶原酶Ⅴ(含DNaseⅠ100 U)逆行注射、原位消化可有效避免因消化时胶状物质的产生而导致的胰岛细胞分离失败,Hitopque-1077梯度离心分离方法具有操作简单、便捷、成功率高等特点,可得到活性与功能较好的胰岛细胞;与加尾法相比,茎环法能够更灵敏地检测胰岛细胞miR-126的表达量。     

过表达热休克蛋白70提高CHO细胞表达抗体的能力

通过在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中过表达热休克蛋白70以提高其表达抗体的能力。首先从中国仓鼠基因组DNA中扩取HSP70基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1-HSP70,再将重组质粒稳定转染到CHO/dhfr-细胞中,筛选获得稳定的细胞系,运用RT-qPCR检测和Western blot分析HSP70基因的过表达。在过表达HSP70的CHO细胞组和对照细胞组(转染空载体pcDNA3.1的CHO细胞组)中分别转染表达抗-HBs的质粒,应用ELISA检测两组细胞表达抗-HBs的能力。RT-qPCR结果显示实验组CHO细胞中HSP70基因的表达量明显高于对照组细胞;ELISA检测结果表明过表达HSP70的CHO细胞组抗-HBs表达量高于对照组细胞(P<0.05)。研究揭示HSP70能有效促进细胞内分泌性蛋白的表达。     

shRNA随机文库结合TK自杀基因筛选靶向HIV-1LTR相关宿主因子

构建shRNA随机文库与HIV-1 LTR启动胸苷激酶基因(TK基因)稳定表达的稳定细胞系HEK293/TK,将两者结合起来,筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子.方法:通过化学合成含有19个随机脱氧核苷酸的发夹结构,将其退火补平后与合成的接头Linker连接进行PCR反应,将PCR产物酶切后置于慢病毒载体pLenti-U6启动子下游由此构建shRNA随机文库;利用重叠PCR将HIV-1 LTR片段和TK基因连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系HEK293/TK;将所获得的文库质粒包装成慢病毒后侵染所构建的HEK293/TK细胞系,通过加入药物GCV进行加压筛选获得存活细胞.结果:成功筛选到加药后存活下来的细胞,抽提细胞基因组,采用巢式PCR扩增目的干扰序列并用Western blot对干扰序列进行验证,鉴定获得一个克隆所表达的shRNA能对TK基因的表达起到抑制作用,通过测序分析获得其干扰序列,该序列很有可能针对HIV-1 LTR某宿主相关因子.结论:成功构建了一种筛选HIV-1 LTR相关宿主因子的方法,筛选所得序列可以定位到具体相关宿主因子,为靶向筛选抗HIV-1药物提供了重要手段.     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体

目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白( alpha-crystallin Acr)的人源抗体.方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析.将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定.结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.成功制备了可溶性单链抗体.Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合.结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

结核分枝杆菌16-kDa α晶体蛋白的原核表达及纯化

目的:利用基因工程技术原核表达并纯化结核分枝杆菌α晶体蛋白(Acr)。方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增Acr的编码基因,以pCold为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析和纯化该表达产物。结果:构建了具有正确基因序列的Acr重组表达质粒,重组Acr在大肠杆菌BL21(DE3)中经低温诱导得到可溶性表达;分别用6×His的单克隆抗体和16-kDa单克隆抗体对表达产物进行Western印迹分析,结果显示在相对分子质量约19 000处均有特异性条带,与预计大小吻合;纯化后蛋白纯度达90%,浓度达0.8 mg/mL。结论:表达了重组可溶性Acr,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。     

粪肠球菌噬菌体vB_E. faecalis_IME196的生物学特性及其全基因组分析

【目的】从医院污水中分离一株能裂解多耐药粪肠球菌的噬菌体,分析该噬菌体的生物学特性,并进行全基因组测序和分析,为治疗和控制多耐药粪肠球菌感染提供基础。【方法】以耐药粪肠球菌为宿主,从医院污水分离噬菌体,双层平板法检测噬菌体效价、最佳感染复数(MOI)和一步生长曲线,纯化后负染法电镜观察噬菌体形态;蛋白酶K/SDS法提取噬菌体全基因组,酶切处理后琼脂糖凝胶电泳分析,使用Ion Torrent测序平台进行噬菌体全基因组测序,测序后进行噬菌体全基因组序列组装、注释、进化分析和比较分析。【结果】分离到一株粪肠球菌噬菌体,命名为v B_E.faecalis_IME196(IME196);其最佳感染复数为0.01,一步生长曲线显示IME196的潜伏期为30 min,暴发量为50 PFU,电镜观察该噬菌体为长尾噬菌体,结合BLASTp分析确定其属于尾病毒目长尾噬菌体科,基因测序表明,噬菌体IME196核酸类型为DNA,基因组全长为38 895 bp,G+C含量为33.9%。【结论】分离鉴定一株粪肠球菌噬菌体,进行了全基因组测序和分析,为以后预防和控制粪肠球菌的感染提供了一个新的途径,为噬菌体治疗多重耐药细菌奠定了基础。     

利用移码突变和终止密码子提高下游目的基因的表达水平

目的:在基因结构复杂的慢病毒载体插入报告基因并提高目的基因表达量。方法:慢病毒载体上有复杂的基因排列,为了不影响慢病毒载体的活性,必须尽量保留原有的基因,替换不必要的基因。首先将报告基因萤光素酶插入慢病毒载体替换基因Env后,结果检测不到报告基因的表达。为了提高报告基因的表达水平,将报告基因的读码框向后移动一个碱基,同时在其上游增加一个终止密码子,然后检测报告基因的表达水平。结果:通过移动报告基因的读码框同时在上游增加终止密码子,使报告基因的表达水平大大提高。结论:在构建基因表达载体时,通过改变目的基因与上游起始密码子ATG之间的相对位置以及增加终止密码子,可以大幅提高目的基因的表达水平。     

基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成中多位点缺失突变的校正方法

目的:建立一种PCR方法,以快速校正基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的多位点缺失突变。方法:用PCR方法合成基孔肯雅病毒非结构蛋白基因;对测序的克隆进行序列比对,分析不同克隆上缺失突变发生的位置,以保守区域互相重叠的寡核苷酸为上下游引物、以该区域测序正确的克隆为模板进行PCR扩增,得到所需片段,再将这些片段用PCR方法进一步组装成完整的基因序列并进行测序。结果:测序结果表明,经过2次PCR扩增,校正了基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的5个位点缺失突变。结论:得到序列正确的基孔肯雅病毒非结构蛋白基因。在进行基因合成过程中如发生多位点缺失突变,可利用该方法同时对以上突变进行校正,无须再合成引物,降低了实验操作难度,并提高了实验效率。     

利用siRNA高通量测序技术筛查蚊子体内携带的RNA病毒

昆虫可以利用小干扰RNA(siRNA)机制干扰体内RNA病毒的增殖,从而获得对该病毒的免疫能力。通过第二代测序技术对蚊子的小RNA进行高通量测序,再通过生物信息学方法寻找其中的RNA病毒序列,发现在我国云南地区的白纹伊蚊和致倦库蚊体内存在Marayo,Omsk hemorrhagic fever和Ilheus等RNA病毒的基因片段。至此建立了发现媒介昆虫体内携带病毒的一种新方法,可用于媒介昆虫携带RNA病毒的本底调查。