猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白,用于E2蛋白功能、开发CSF新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法采用RT-PCR扩增CSFV E2基因,将PCR产物克隆到pGEM-T-Easy载体,将该基因插入到pFast-BacHT A载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western-blot及免疫组化鉴定。结果成功克隆CSFVE2基因,其核苷酸序列为1119 bp。SDS-PAGE电泳结果显示表达E2蛋白相对分子质量约为43×103,Western-blot和免疫组化结果证实表达蛋白能够被CSFV标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的成功表达了CSFV E2蛋白,与CSFV标准阳性血清具有较好的反应性。     

犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的表达犬细小病毒VP2蛋白（CPVVP2）,用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究。方法采用PCR方法对CPVVP2基因进行扩增,将CPVVP2基因克隆到毕赤酵母（Pichiapastoris）分泌表达载体pPICZαA中,构建真核重组表达载体pPICZαA—VP2,将该重组质粒线性化后,转化毕赤酵母菌GS115中,在甲醇诱导下表达CPVVP2,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白。结果成功扩增了CPVVP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZαA-VP2在毕赤酵母菌中表达出约64．35kD蛋白。Western blotting鉴定表明,表达VP2蛋白与犬细小病毒阳性血清有反应性。结论在毕赤酵母中成功地表达了CPVVP2蛋白,能被犬细小病毒阳性血清识别。     

禽流感病毒A型和H5亚型RT-PCR检测试剂盒研究

目的　检测和鉴定A型、H5亚型禽流感病毒 (AIV) ,研发一种高效实用的检测手段。方法　根据Ming ShiuhLee报道的文献设计、合成引物 ,采用反转录和PCR一步法对A型、H5亚型禽流感病毒cDNA进行扩增和电泳鉴定 ,组装成禽流感病毒RT PCR试剂盒 ,对H1～ 15亚型AIV参考株、38份AIV国内分离株进行检测试验。结果　建立了A型、H5亚型禽流感病毒RT PCR检测方法 ,并在此基础上组装试剂盒 ,用A型试剂盒检测时 ,全部AIV毒株均为阳性 ,能检测 1 10 2 4血凝单位禽流感病毒 ;用H5亚型试剂盒检测时 ,仅有H5亚型AIV参考株和 19株H5亚型AIV分离株呈阳性 ,其余H1～H4、H6～H15参考株和H7、H9分离株以及 1株H5分株均为阴性 ,能检测1 6 4血凝单位禽流感病毒。 2种试剂盒对实验感染鸡病料检出率均为 10 0 %。结论　研制的AIVA型、H5亚型RT PCR试剂盒具有特异性强、敏感性高、稳定性和重复性好的特点。     

基于复杂网络的脑疾病功能网络研究进展

脑功能连接能够反映脑区间的相互联系状况,目前已成为脑功能研究的主要方法。复杂网络方法源于图论分析,可以对功能连接所构网络进行量化分析,提供多种量化指标。本文介绍了当前复杂网络的多种基本概念,及其在几种典型脑部疾病上的应用情况。     

禽流感病毒H5N1亚型NS1基因在大肠杆菌中的表达

目的表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)NS1蛋白,用于AIV感染与注射灭活疫苗鸡的鉴别诊断和NS1蛋白功能研究。方法采用RT_PCR方法对H5N1亚型AIVNS1基因进行扩增,将PCR产物克隆于pGEM_T_easy载体,将该基因插入pGEX_4T_1中构建NS1基因原核表达载体,转化BL21大肠杆菌后,在IPTG诱导下表达NS1蛋白,Westernblot鉴定表达NS1蛋白。结果成功克隆H5N1亚型AIV的NS1基因,其核苷酸序列长度为690bp,编码230个氨基酸残基。构建NS1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约51×103的NS1融合蛋白。Westernblot鉴定表明表达NS1蛋白与H7N2AIV感染鸡血清有反应性。结论在大肠杆菌中成功表达了H5N1亚型AIVNS1基因蛋白,具有与感染H7N2亚型AIV阳性血清反应原性。     

禽流感病毒H7N2血凝素HA1基因在大肠杆菌中的表达

目的　表达H7N2亚型禽流感病毒 (AIV)HA1基因 ,用于感染H7亚型禽流感病毒抗体的检测和HA1蛋白功能研究。方法　采用RT PCR方法对H7N2亚型AIVHA1基因进行扩增 ,将PCR产物克隆于pGEM T Easy载体 ,将该基因插入pGEX 4T 2中构建HA1基因原核表达载体 ,转化BL2 1大肠杆菌后 ,在IPTG诱导下表达HA1蛋白 ,Westernblot鉴定表达HA1蛋白。电洗脱方法纯化表达HA1蛋白 ,建立间接ELISA方法 ,对感染AIVH7、H9、H5亚型AIV阳性血清进行检测。结果　成功克隆H7N2亚型AIV的HA1基因 ,其核苷酸序列长度 96 6bp ,编码 32 2个氨基酸残基。构建HA1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约 6 1× 10 3的HA1融合蛋白。Westernblot和ELISA方法鉴定表明 :表达HA1蛋白与感染H7亚型AIV鸡血清有反应 ,与H5、H9亚型AIV阳性血清没有反应。结论　本研究在大肠杆菌中成功表达了H7N2亚型AIVHA1基因蛋白 ,具有与感染H7亚型AIV阳性血清反应原性 ,不与H5和H9亚型AIV感染阳性血清发生反应。     

禽流感病毒分离株NS基因同源性及等位基因类型分析

目的　克隆测定国内具有代表性的禽流感病毒 (AIV)的非结构 (NS)蛋白基因核苷酸序列 ,分析其同源性和等位基因类型 ,为进一步探索禽流感NS蛋白抗体监测方法奠定基础。方法　经RT PCR扩增了国内 3株H9N2、2株H5N1、2株H7N2亚型AIV分离株的NS蛋白基因 ,并把扩增的基因片段克隆到pGEM T载体中测序 ,将测序结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较 ,绘制基因进化树。结果　经测序获得了各AIV分离株NS基因的完整编码序列。同源性分析表明 ,3株H9亚型AIV的NS基因之间的同源性为 96 %～ 98% ;两株H5亚型AIVNS基因同源性为 91 6 % ;两株H7亚型AIV的NS基因同源性为 98 9%。H5和H9亚型分离株的NS基因之间的同源性均高于 90 % ;而H7N2亚型分离株与其它两种亚型分离株的NS基因同源性约为 6 0 %～ 70 %。在AIVNS基因系统发育进化树中 ,H5、H9亚型分离株都处于等位基因A群内 ;3株H9亚型分离株的进化关系较近 ,与香港、广东的部分H5N1病毒株起源相同 ,而 2株H5病毒的NS基因则处于不同分枝内 ;2株H7亚型分离株的NS基因都处于等位基因B群内 ,进化关系较近。结论　这 7株国内AIV分离株的NS基因之间的同源性差异较大 ,约为 6 0 %～ 99% ,且包括A、B两种类型的等位基因     

Caspase-1、OPN在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者血清中的表达及其临床意义

摘要 目的：探讨半胱氨酸蛋白酶-1 (Caspase-1)、骨桥蛋白（OPN）在慢加急性乙型肝炎肝衰竭（HBV-ACLF）患者血清中的表达及其临床意义。方法：选择2020年6月至2022年6月中国人民解放军联勤保障部队第九七Ο医院收治的86例HBV-ACLF患者（HBV-ACLF组）;另选取同时段接诊的58例慢性HBV感染患者（CHB组）;收集同时间段60例体检的健康志愿者（对照组）。检测所有受试者血清Caspase-1、OPN、肝功能指标水平,探讨HBV-ACLF患者血清Caspase-1、OPN水平与肝功能指标的相关性,单因素分析及Logistic多元逐步回归分析影响HBV-ACLF患者预后的危险因素。结果：三组血清Caspase-1、OPN、肝功能指标水平比较差异有统计学意义（P＜0.01）。HBV-ACLF组、CHB组血清Caspase-1、OPN、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）水平高于对照组（P＜0.05）,白蛋白（Alb）、胆碱酯酶（CHE）水平低于对照组（P＜0.05）,HBV-ACLF组血清Caspase-1、OPN 、ALT 、AST 、TBIL水平高于CHB组（P＜0.05）,Alb、CHE水平低于CHB组（P＜0.05）。Pearson相关分析显示,HBV-ACLF患者血清Caspase-1、OPN水平均与ALT、AST、TBIL呈正相关（P＜0.05）,与Alb、CHE呈负相关（P＜0.05）。单因素分析显示,HBV-ACLF患者预后与肝硬化、肝性脑病、腹膜炎发生率、终末期肝病评分模型（MELD）评分、白细胞计数（WBC）、血小板计数（PLT）、肌酐（Cr）、国际标准化比值（INR）、TBIL、HBV-DNA载量（HBV-DNA）、Caspase-1、OPN有关（P＜0.05）;而与年龄、性别、血红蛋白（HGB）、BUN、ALT、AST、CHE、Alb无关（P>0.05）。Logistic多元逐步回归分析模型结果显示,HBV-DNA、MELD评分、Caspase-1、OPN是影响HBV-ACLF患者预后的危险因素（P＜0.05）。结论：HBV-ACLF患者血清Caspase-1、OPN水平呈异常高表达,且Caspase-1、OPN高表达水平与肝功能恶化和不良临床结局有关,可为HBV-ACLF患者病情进展及预后评估提供依据。     

脉冲式及伪连续式动脉自旋标记技术静息态脑灌注对比研究北大核心CSCD

比较研究了脉冲式动脉自旋标记(pulsed arterial spin labeling,PASL)和伪连续式动脉自旋标记(pseudo continuous arterial spin labeling,pCASL)两种磁共振成像技术在静息态脑灌注中的应用。在静息态下,采用两种动脉自旋标记技术采集了10例健康志愿者的脑灌注数据,并计算脑血流量。两种技术的测量结果均显示,人脑默认网络中的楔前叶、角回、岛叶和后扣带回的相对脑血流量高于全脑平均灌注,而pCASL更敏感。在白质、额叶、顶叶、小脑和小脑蚓区域,pCASL和PASL测量得到的灌注值有显著性差异,除枕叶、小脑和小脑蚓外,PASL测量得到的灌注量小于pCASL。在全脑范围内,pCASL的信噪比明显高于PASL,且负灌注量很少。实验表明,pCASL可以提供比PASL更准确的测量结果。     

狂犬病病毒糖蛋白在大肠埃希菌中的表达及鉴定

目的表达狂犬病病毒糖蛋白（GP）,用于狂犬病疫苗免疫抗体评估和狂犬病病毒糖蛋白功能的研究。方法采用分析软件,分析其可能的抗原表位,利用PCR方法扩增狂犬病病毒SRV9疫苗株G蛋白抗原位点区域基因,PCR产物经EcoRI和SalI双酶切后,插入大肠埃希菌表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞中,在IPTG诱导下表达目的蛋白,进行SDS-PAGE分析。表达蛋白进行电洗脱纯化和Western blot鉴定分析。结果成功构建了pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a表达质粒,序列分析表明,插入片段大小分别为1314 bp和1275 bp。SDS-PAGE分析结果证明,在大肠埃希菌系统中成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达的融合蛋白含有GST标签,大小分别约为74×103和73×103。Western blot鉴定结果表明,表达产物有抗原特异性并能与狂犬病病毒抗血清反应。结论利用大肠埃希菌表达系统成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达产物有良好的反应原性。