新的热带假丝酵母载体-宿主系统的建立

热带假丝酵母(Candida tropicalis)是一种可以利用多种非糖碳源代谢的微生物,在石油发酵、石油化工生产领域已得到长期应用^[1]。随着分子生物学研究技术的发展。通过代谢工程技术改变热带假丝酵母的代谢途径和流向．发展出能够把石油中的烃类物质发酵转化成各种重要化工原料、中间体的新型生产菌株,已普遍受到国内外研究机构的重视。另一方面,热带假丝酵母具有细胞生长密度高,分泌蛋白能力强等特点,可以发展成一个重要的异源蛋白表达体系。建立稳定高效的热带假丝酵母载体一宿主系统是实现上述构想的前提和关键。迄今为止,在热带假丝酵母细胞内尚未发现能游离于染色体外自主复制的天然质粒存在。目前已有20余种热带假丝酵母基因被克隆和鉴定。大部分与热带假丝酵母的氧化代谢过程有关,其中5个过氧物酶体蛋白基因的结构和2个细胞色素P450系统基因的表达调控规律巳被阐明^[2-5],与DNA复制过程有关的基因或功能序列均未见报道。本文研究和探索Candida属其他微生物基因元件在热带假酵母中的功能作用,选用热带假丝酵母细胞色素P450单加氧酶基因的启动子和侧翼调控序列^[3],构建了一套新的热带假丝酵母载体一宿主系统,并成功地表达了小鼠CYPlAl基因。     

人胰岛素原C肽的表达、纯化及其细胞活性研究

近年来研究发现人胰岛素原C肽 (简称C肽 )有多种生物活性 ,在治疗糖尿病的并发症中有潜在的应用价值。在前期研究中 ,完成了多拷贝串联C肽基因的构建和融合表达 ,在原核中获得了高表达。用发酵的方法大规模表达融合蛋白C肽 (FCP) ,由Ni-NTA柱亲和纯化获得的蛋白经胰蛋白酶和羧肽酶B的酶解及RP HPLC分离获得了纯度超过 95 %的C肽单体。细胞活性研究显示它对U2 5 1、2 93细胞的生长具有一定的促进作用     

蛇毒丝氨酸蛋白酶

蛇毒是含有许多种生物活性蛋白质和多肽的复杂混合物 ,在蛇毒中蛋白酶占据着独特的位置 ,特别是蝰亚科和蝮亚科。目前可将蛇毒中蛋白水解酶主要分成两大类 ,其中一类是可被ＰＭＳＦ或ＤＦＰ抑制其活性的丝氨酸蛋白酶类。它们的蛋白质序列与胰蛋白酶、激肽释放酶比较显示较大同源性 ,均具有一个共同活性中心和相同的酶催化机制。但由于活性中心外的序列差异导致底物专一性差异和生物活性差异。另一类是可被金属螯合剂ＥＤＴＡ抑制其活性的金属蛋白酶类。一般说来 ,参加它们催化作用活性中心的金属离子是锌 ,隶属于一个新的金属蛋白酶亚科 (ｍ…     

蛇毒纤溶酶原激活剂TSV-PA在昆虫细胞中的表达

将蛇毒TSV PA基因插入昆虫杆状病毒供体质粒pFastBacHTa中 ,在粉纹夜蛾Tn 5B1 4细胞中进行表达。SDS PAGE分析结果表明 ,表达产物为分子量 33kD的TSV PA蛋白 ,Western印迹分析也证实了此结果。酶活力测定结果表明 ,昆虫细胞表达的TSV PA蛋白具有较高活性     

PCR及其衍生技术在基因突变检测中的应用

许多人类遗传性疾病及某些抗艾滋病药物的抗性乃至细菌对某些抗生素的抗药性通常源于基因突变。本文对近年来在基因突变检测中应用日益广泛的各种PCR 衍生技术作一综述;重点介绍了错配PCR技术,以及我们实验室近期报道的一种快速检测喹诺酮类药物耐药大肠杆菌的错配PCR方案。 Abstract:Many inherited diseases and drug resistance have been attributed to mutations in corresponding genes.In this paper,several techniques based on PCR used in diagnosis were concluded.The development and research progress of Mismatch PCR were discussed in details.Some information about an assay that we developed for detection of antimicrobial resistance to quinolones was also described.     

肱骨近端锁定接骨板结合抗骨质疏松药物治疗老年骨质疏松性肱骨近端粉碎性骨折的疗效观察

目的:探讨肱骨近端锁定接骨板(LPHP)结合抗骨质疏松药物治疗老年骨质疏松性肱骨近端粉碎性骨折(OP-CFPH)的疗效价值。方法:抽选我院2012年1月-2014年2月收治的45例老年OP-CFPH患者,采用随机分层法分为对照组(n=22例,采用三叶形普通钢板治疗)和观察组(n=23例,采用LPHP+入院后抗骨质疏松治疗),比较两组手术参数、术后肩关节Neer评分及并发症发生率的差异。结果:观察组手术时间、术中出血量、术后引流量及术后骨折愈合时间均显著低于对照组的,组间差异具有统计学意义(P0.05);观察组术后肩关节Neer评分优良率明显高于对照组(P0.05);术后观察组并发症发生率低于对照组,但比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:LPHP联合抗骨质疏松治疗老年OP-PHF具有创伤小、疗效好的优点,有利于骨折愈合,是目前治疗该类骨折一种理想的方法。     

BLyS对噬菌体随机12肽库的筛选

用B淋巴细胞刺激因子（BLyS）对噬菌体随机12肽库进行亲和淘洗,3轮筛选后阳性噬菌体得到富集。用ELISA鉴定噬菌体克隆,多个阳性克隆测序后得到了同一个小肽序列(RHKIQLRQNIIT)。将该小肽与GST融合,在大肠杆菌中进行表达及纯化,ELISA实验进一步验证了其具有与BLyS特异结合的活性。该小肽有可能成为其天然受体的拮抗剂。      

非随机方法构建酿酒酵母基因工程菌

酿酒酵母是基因工程产品研究和生产的一个重要表达系统,表达载体和宿主细胞是构成表达系统的两大要素,虽然外源基因表达的方式、强度主要由表达载体控制．但宿主细胞的选择对最终获取产品的质量和数量也具有十分关键的作用。酿酒酵母基因工程宿主菌除要求具有高的DNA转化效率、细胞生长密度和稳定性、低的内源蛋白水解酶活性外,还必须具备与表达载体相对应的营养缺陷筛选标记,用传统随机诱变方法得到的营养缺陷变异株,因含有本底和隐性突变,在细胞生长密度和稳定性方面往往不能满足基因工程产品研究和生产的要求,甚至不能有效地表达外源基因。本文报道用重组技术,通过非随机方法构建了酿酒酵母基因工程宿主茁。研究表明用该方法得到的宿主菌在细胞生长密度、稳定性和表达外源基因方面优于用传统随机诱变方法得到的宿主菌。