氨糖合酶的定向改造及其在氨糖生物合成中的应用

本研究采用基因工程手段克隆表达和定向改造氨糖合酶GLS,并通过共表达氨糖乙酰化酶GNAL进一步增强宿主菌氨糖产生能力。首先通过不同表达质粒和宿主的优化筛选出最优GLS表达体系,成功构建获得E.coli Rosetta-gami(DE3)-p ET-24a-GLS工程菌,检测其氨糖Glc N产量为1.63 g/L。为提升重组酶的转化能力,采用易错PCR技术对氨糖合酶进行非理性改造,通过高通量筛选方法从2 700余株克隆的文库中筛选获得一株高产Glc N的突变株,其产量达到3.57 g/L,相比出发菌株提高1.19倍。由于Glc N的积累对于氨糖合酶重组菌生长及代谢活动具有一定的抑制作用,本研究进一步通过共表达氨糖乙酰化酶GNAL,将Glc N部分转化为乙酰化氨糖Glc NAc,减少产物的抑制效应,结果表明GNAL与GLS串联表达能显著提升菌株的转化能力,Glc N及Glc NAc累积产量达到7.83 g/L,比单独表达GLS时提升2.19倍。经过初步摇瓶发酵优化,在5 L发酵罐上最高产量达到9.85 g/L。本研究从GLS的改造策略出发,通过易错PCR非理性改造的方式提升了GLS对于产物氨糖的耐受性,增强了GLS合成氨糖的能力,为进一步提升大肠杆菌发酵合成氨糖能力奠定基础。     

高通量测序技术在食品微生物研究中的应用

高通量测序技术的快速发展对食品微生物发酵过程和机制研究产生了深刻的影响,主要体现在食品微生物生理功能、代谢能力和进化的研究以及食品微生物群落结构、动态变化及其对环境的响应机制等方面。另外,通过对食品微生物基因组和元基因组进行数据分析,也对食品发酵过程优化、微生物功能改造、食源性微生物疾病预防和控制等提供了重要的依据。本文总结了近年来利用高通量测序技术对食品微生物基因组和元基因组进行测序的研究,并探讨了测序技术的发展对食品微生物研究的影响及发展趋势。     

产芳香腈水解酶的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida CGMCC3830的筛选、鉴定及发酵优化(英文)

近年来微生物腈水解酶水解腈类化合物制备有机酸已逐步受到关注。本研究分离到一株表现出较高腈水解酶活力的细菌菌株,通过形态学、生理生化实验以及16S rRNA基因序列分析将其鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida CGMCC3830。结合单因素及响应面法对该菌株产腈水解酶的发酵条件进行了优化,获得最适培养条件为:甘油13.54 g/L,胰蛋白胨11.59 g/L,酵母粉5.21 g/L,KH2PO4 1 g/L,NaCl 1 g/L,脲1 g/L,初始pH 6.0及培养温度30℃。通过优化,酶活由2.02 U/mL提升至36.12 U/mL。对该菌株底物特异性的考察结果表明,恶臭假单胞菌腈水解酶对芳香族腈类化合物具有较高的水解活力。将其应用于烟酸的生物合成中,2 mg/mL游离细胞能90 min内将20.8 g/L 3-氰基吡啶彻底转化,制备得到相应烟酸。这些结果表明恶臭假单胞菌P.putida CGMCC3830在烟酸的规模化生产中具有一定的应用潜力。     

海藻糖酶产生菌的选育、鉴定及其酶学特性初探

海藻糖酶可特异性将1分子海藻糖分解为2分子葡萄糖,在乙醇工业、食品等行业中具有广阔的应用前景。从环境土壤中筛选到1株海藻糖酶产生菌C2,根据形态学分析和分子生物学鉴定将其命名为大黄欧文氏菌（Erwinia rhapontici）。该菌株产海藻糖酶的最适温度为40 ℃,最适pH为5.0,在酸性及低于35 ℃条件下,该酶具有较高的稳定性,Ca²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、K⁺、Na⁺和Fe²⁺对海藻糖酶酶活具有促进作用,DMSO和DTT对酶活具有一定的提升作用,而Triton X-114、SDS和PMSF则对酶活具有抑制作用。     

杓兰果胶杆菌海藻糖酶的克隆表达及应用

海藻糖酶在工业发酵和食品医药等领域应用广泛,我国缺乏性能优良工业品种的海藻糖酶,同时在应用研究领域还不够深入。本研究从自然界筛选获得一株产酸性海藻糖酶的杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii),克隆获得其海藻糖酶基因PCTre,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)体系中实现了重组表达,在5L发酵罐上28h产酶达到4130U/mL。酶学性质研究显示,PCTre能特异性水解海藻糖,最适反应温度和pH分别是35℃和5.5,在pH4.0、4.5、5.0处理8h后残余酶活仍超过80%,表现出良好的耐酸性。同时该酶还显示出优良的有机溶剂耐受性,在20%(V/V)乙醇溶液中处理24h仍能保留60%的酶活。进一步在含有20%(V/V)乙醇和7.5%海藻糖的模拟发酵体系中,当添加500U/L PCTre,可在16h内完全水解海藻糖,具有良好的应用于工业乙醇发酵的潜力。     

利用语义网技术实现的分布式异构食品微生物数据整合

随着高通量测序技术的迅速发展和食品微生物研究的逐步深入,产生了大量的数据和知识,且以不同的数据格式分布在各种数据库中。为了更好地支持食品微生物的相关研究,从各种分布式、异构的数据和知识中,进行数据提取与转换,并形成一个整合的数据平台显得尤为重要。FoodMicrobes数据库利用语义网技术,建立了一个食品微生物的整合型数据平台。该平台从各种开放的公共数据库,提取了与食品微生物相关的基因、基因组、基因功能、蛋白质序列与结构、代谢途径、文献、专利等信息,利用RDF的方法,对数据进行转换,并建立了数据之间的关联,实现了数据整合,是目前在食品微生物领域以语义网方式建立的第一个数据库。在该平台中,实现了将食品微生物的物种、菌株层面的宏观信息与基因组、蛋白质、代谢与功能等微观层面信息的贯通,并通过友好的数据检索界面,为用户进行食品微生物研究提供了重要的工具。     

腈水解酶psn基因工程菌的发酵及产酶条件优化

来自恶臭假单胞菌的腈水解酶具有高效催化3-氰基吡啶产烟酸的能力,对表达该酶的基因psn进行发酵和产酶条件优化,通过对C源、N源、磷酸盐、金属离子、温度、诱导剂浓度和诱导时间进行单因素考察,获得最适培养基条件(g/L):葡萄糖5、蛋白胨15、酵母粉5、(NH4)2SO45、K2HPO424.5、KH2PO45.76、MgSO40.48;最佳诱导条件:培养2.5 h后添加IPTG诱导,浓度0.2 mmol/L,诱导温度30℃。在该条件下培养,重组大肠杆菌的腈水解酶比酶活可达到45.67 U/mL,比优化前提高了2.26倍。在此基础上,于5 L发酵罐上进行C、N源的补料研究,获得最适分批补料策略,发现其腈水解酶活力可达到75.40 U/mL,是优化前的3.74倍。     

生物催化3-(4-氯苯基)-戊二腈去对称性水解合成光学纯巴氯芬的关键前体

研究了利用生物催化剂制备(S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸.以3-(4-氯苯基)-戊二腈为底物,采用苯酚-次氯酸钠法对实验室保藏的菌株进行筛选,得到一株产物立体选择性较高的菌株赤霉菌Gibberella intermedia WX12,并对其催化特性和发酵条件进行了初步研究.以30 g/L的乳糖和20 g/L的蛋白胨分别为碳、氮源,发酵培养96 h,收集的菌体在50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 8.0)中30℃催化反应24 h,将3-(4-氯苯基)-戊二腈转化为4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸,产率为90％.将产物化学转化为巴氯芬,手性HPLC分析表明水解产物构型是(S),其对映异构体过量值ee＞ 99％.该产物可以用来合成光学纯的(R)-和(S)-巴氯芬.     

芽孢杆菌N1碱性蛋白酶的克隆表达及酶学性质

【背景】蛋白酶广泛应用于制革行业中,酶法脱毛对环境污染较小,但蛋白酶对化学试剂的不稳定性及胶原降解活性限制了其工业应用。【目的】克隆芽孢杆菌(Bacillussp.)N1基因组的碱性蛋白酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,并对重组酶酶学性质及脱毛作用进行研究。【方法】利用基因组文库法克隆获得蛋白酶基因aprG,构建重组大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)pLysS/pET-28a-aprG。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达该重组酶,以福林酚显色法对其酶学性质进行研究,并将AprG作用于羊皮、兔皮和羽毛。【结果】克隆得到蛋白酶基因aprG,并实现其在大肠杆菌中的表达。重组酶AprG最适反应温度为50°C,最适反应pH为10.0。各种金属离子对AprG活性影响较小,且AprG对表面活性剂和氧化剂、还原剂的耐受性较强。底物特异性分析表明,该酶胶原活性较低。AprG对羊皮和兔皮作用显著,且降解羽毛效果明显。【结论】蛋白酶AprG在制革行业中具有良好的应用前景。     

响应面法优化深层发酵樟芝总三萜的提取工艺(英文)

采用响应面法对樟芝深层培养中总三萜的提取工艺进行优化。根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理,在单因素实验的基础上,选取溶剂浓度、提取温度和液固比为变量,应用响应面法进行三因素三水平的实验设计。以总三萜得率作为响应值,建立了樟芝总三萜提取的回归模型,对其提取条件进行进一步优化。结果表明,优化的总三萜提取条件为乙醇浓度86%,提取温度75℃,液固比37。进一步的实验也验证了该模型的有效性。