基于转录组测序的宁夏枸杞不同品种果实活性成分合成差异表达基因分析

为探究不同品种宁夏枸杞果实活性成分生物合成相关基因的表达水平,筛选关键差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),揭示宁夏枸杞品种间活性成分含量差异的分子机制,本研究采用Illumina NovaSeq 6000高通量测序技术,对宁夏枸杞‘宁杞1号’和‘宁杞7号’青果期、转色期及成熟期果实进行转录组测序,比较2个品种果实不同发育期相关基因表达谱的变化。结果显示:转录组测序共获得811818178条clean reads,有121.76 Gb有效数据。‘宁杞1号’和‘宁杞7号’在青果期、转色期和成熟期差异表达基因分别有2827、2552和2311个;分别有2153、2050和1825个差异基因在基因本体论(gene ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析和同源蛋白簇(clusters of orthologous groups of proteins,KOG)分析等6个数据库中被成功注释。青果期、转色期和成熟期果实的差异表达基因,在GO数据库分别有1307、865和624个被富集到生物学过程、细胞组分及分子功能3个部分中;KEGG通路富集结果均集中在代谢途径、次生代谢物生物合成和植物-病原互作过程;在KOG数据库,3个发育期分别注释了1775、1751和1541个差异表达基因。对注释的基因进行PubMed数据库检索,在青果期、转色期和成熟期分别筛选到与枸杞活性成分合成相关的差异表达基因18、26和24个,这些基因主要参与类胡萝卜素、类黄酮、萜类、生物碱和维生素等代谢途径。选取7个差异表达基因进行RT-qPCR验证,结果与转录组测序数据表达趋势一致。本研究从转录水平为不同品种宁夏枸杞活性成分含量差异提供了初步证据,为进一步挖掘枸杞活性成分生物合成的关键基因及解析其表达调控机制提供了研究基础。     

人博卡病毒基因克隆及衣壳编码基因序列变异分析

为了解人博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)VP1基因进化关系;阐明HBoV目前具体的变化规律,用PCR的方法扩增了1株HBoV的全基因和9株HBoV的VP1基因,克隆并测序,在此基础上,将HBoV的全基因序列和衣壳序列分别与细小病毒亚科其他14个有代表性的病毒进行遗传分析,构建进化树,对目前所有可得到的HBoV的17个衣壳蛋白进行二级结构分析和抗原性分析。结果显示:HBoV全基因序列与B19关系较远,但衣壳序列遗传关系较近。以有典型性的猫瘟细小病毒(Feline parvovirus,FPV)衣壳蛋白为参照,分析多个HBoV衣壳序列之间的变异情况,显示HBoV衣壳的二级结构基础表现出较高的保守性,序列之间的变化主要发生在高抗原区域和感染活性区域。衣壳病毒变异情况显示HBoV在稳定自身的情况下表现出一定的活跃性以逃避免疫反应,也表现出一定的感染适应力。     

从噬菌体随机肽库中筛选流感病毒神经氨酸酶的抑制多肽

目的:从噬菌体呈现12肽库中筛选与流感病毒神经氨酸酶特异性结合的肽。方法:以甲三型流感病毒裂解疫苗原液为靶分子,经过3轮生物淘选,从噬菌体随机肽库中筛选与之结合的噬菌体。用ELISA方法鉴定噬菌体克隆与靶分子的结合力,用荧光方法测定噬菌体克隆对流感病毒A/Sydney/5/97(H3N2)神经氨酸酶的抑制活性。对筛选到的阳性克隆进行DNA序列测定并推导出相应的氨基酸序列。结果:经过3轮筛选后,42个噬菌体克隆与靶分子有高度亲和力,23个噬菌体克隆对流感病毒A/Sydney/5/97(H3N2)神经氨酸酶有抑制活性。对27个噬菌体克隆的测序结果表明,分别有10个和2个克隆的序列是一致的,其氨基酸序列分别为KSLSRHDHIHHH和WPRHHHSASVQT。结论:通过噬菌体肽库筛选到抑制流感病毒神经氨酸酶的12肽,为进一步研究对流感病毒神经氨酸酶有抑制活性的分子药物奠定了基础。     

南京地区2010～2011年度呼吸道感染患儿腺病毒的流行病学研究

本研究为了解南京地区儿童腺病毒(ADV)感染的流行特点及型别,收集2010年8月至2011年7月南京医科大学附属南京儿童医院住院及门诊呼吸道感染患儿的鼻咽抽吸物(NPA)及咽拭子(NPS)共644例,采用巢氏聚合酶链反应法(Nested-PCR)检测ADV hexon基因,将阳性PCR扩增产物进行测序、同源性和进化分析。同时对12种其他呼吸道相关病毒进行PCR检测,包括人博卡病毒(HBoV),呼吸道合胞病毒(RSV),人鼻病毒(HRV),副流感病毒1～4型(PIV1-4),流感病毒A和B(IFVA/B),人偏肺病毒(HMPV),冠状病毒NL63和HKU1(HCoV-NL63和HCoV-HKU1)。结果显示:644例标本中共检出ADV阳性扩增产物171份,检出率为26.55%,3型120例(70.18%,120/171),7型16例(9.36%,16/171),1型12例(7.02%,12/171),2型10例(5.85%,10/171),5型6例(3.51%,6/171),6型3例(1.75%,3/171),57型3例(1.75%,3/171),41型1例(0.58%,1/171)。ADV感染呈全年散发,其发病高峰主要在4～7月。以7岁以下儿童多见(96.49%)。171例ADV感染患儿中有99例(57.89%)存在混合感染,其中以呼吸道合胞病毒(RSV)、人鼻病毒(HRV)多见。ADV阳性患儿诊断以下呼吸道感染为主(63.16%),肺炎占30.41%。结论:ADV是2010年8月到2011年7月南京地区儿童呼吸道感染的重要病原之一,其优势流行株为3型,长期监测其流行型别具有重要意义。     

中国内陆发现HCoV-HKU1感染及N和S蛋白基因序列及进化分析

了解冠状病毒HKU1在我国大陆地区的感染情况及N基因和S基因的编码特征。采用RT-PCR的方法对2005年10月~2006年1月收集的260例急性呼吸道感染的住院儿童鼻咽抽吸物(NPA)进行了冠状病毒HKU1基因检测。将PCR阳性产物测序,并将所测序列在GenBank中进行比较分析。260份样本中共检测到2份冠状病毒HKU1阳性,阳性率为0.77%(2/260),且该2例冠状病毒HKU1阳性患者临床均表现为肺炎症状。扩增其中一株病毒N和S全基因,并进行测序,与GenBank中的冠状病毒HKU1参考株及冠状病毒科其它成员进行序列同源性和进化树分析,并对N和S蛋白的结构与功能进行了初步的预测分析。由此表明我国大陆地区存在冠状病毒HKU1感染,且可能与儿童下呼吸道感染存在相关性。     

螺旋藻POD、CAT和SOD同工酶的研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对毛乌素沙地碱湖的钝顶螺旋藻S3和鄂尔多斯螺旋藻S4与国外引进的钝顶螺旋藻S1和极大螺旋藻S2 的POD、CAT和SOD同工酶进行了比较研究。结果表明 :4个样品的 3种酶同工酶带数目不同 ,依次是S4 >S3>S1>S2 ;S3和S4 酶带数多 ,对环境适应性强 ,进化程度较高。螺旋藻不同种间的酶谱相似系数为 0 5 3～ 0 80 ,有较近的亲缘关系 ;原产地不同的钝顶螺旋藻S1和S3间酶谱相似系数最高为 0 86,表明螺旋藻种内差异 <种间差异。     

螺旋藻POD、CAT和SOD同工酶的研究*

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对毛乌素沙地碱湖的钝顶螺旋藻S3和鄂尔多斯螺旋藻S4与国外引进的钝顶螺旋藻S₁和极大螺旋藻S₂ 的POD、CAT和SOD同工酶进行了比较研究。结果表明 :4个样品的 3种酶同工酶带数目不同 ,依次是S₄ >S₃>S₁>S₂ ;S₃和S₄ 酶带数多 ,对环境适应性强 ,进化程度较高。螺旋藻不同种间的酶谱相似系数     

环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)在丙型肝炎病毒基因检测中的应用

该文介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中8个基因区段的3对特殊引物,并在反转录酶和Bst-DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应,整个检测反应只需1~2h。利用这种技术成功检测了丙型肝炎病毒基因,对60份经Real-time PCR或RT-PCR验证阳性的血清样品检测,阳性符合率为98%。同时,对扩增终产物进一步进行酶切分析,并与HIV、HBV和不同亚型流感病毒RNA进行交叉反应和特异性测试,均与预期结果吻合。将Real-time PCR定量后的RNA系列稀释后对检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示,该技术的检测灵敏度在理论上可达到10个拷贝的RNA分子。以上结果证明,RT-LAMP扩增技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在丙型肝炎病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力。     

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用

建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测.该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应.对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green Ⅰ为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试.结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性.此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平.因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法.     

北京地区住院患儿WU多瘤病毒感染的流行病学研究

自2007年Gaynor A M等人通过高通量测序在肺炎患儿呼吸道样本中发现了WU多瘤病毒(Washington University polyomavirus,WUPyV)以来,WUPyV在世界各地被广泛检出。为了解北京地区急性呼吸道感染住院儿童中WUPyV感染情况及其临床特征,收集北京地区2017年4月至2018年3月共1 276份呼吸道感染住院患儿的鼻咽抽吸物样本,使用real time PCR方法对样本进行WUPyV检测,同时对WUPyV阳性样本进行17种常见呼吸道病毒筛查。共检出WUPyV阳性样本76份(5.96%,76/1 276),4岁以下儿童居多(92.11%,70/76);WUPyV感染全年可见,无显著季节性;多伴随其他呼吸道病毒混合感染(60.53%,46/76),最常见混合感染为鼻病毒和A型流感病毒;WUPyV单一感染者与混合感染者病毒载量无显著性差异,临床诊断和表现基本一致;WUPyV感染患儿的常见诊断为支气管炎(68.42%,52/76)和肺炎(30.26%,23/76);临床症状主要表现为高热、咳嗽、咳痰。研究结果提示WUPyV是北京地区急性呼吸道感染住院患儿呼吸道样本中常见病毒之一,多见于4岁以下儿童。