重组GluV8的克隆表达、纯化及酶学性质研究

谷氨酰内切酶在生物制药及检测中应用较多,但来源受限,将全基因合成的金黄色葡萄球菌来源的谷氨酰内切酶功能区部分对应的基因进行改造后,克隆入表达载体pGEX-4T-2,导入E.coli BL21（DE3）,重组蛋白以可溶性形式表达。采用亲和层析等纯化步骤对重组蛋白进行纯化,用底物Z-Phe-Leu-Glu-pNA（L-2135）对重组蛋白的酶学性质进行了研究,用HPLC、LC-MS/MS检测方法对酶切融合蛋白的位点特异性进行了鉴定。结果表明该酶的相对活性为1568U/mg,最适作用温度为42℃、最适作用pH为8.0,在pH 9.0,50℃时仍有较高的酶活,将该酶与胰酶酶切融合蛋白所得肽段结合能够提升质谱检测结果的精确度。以上结果表明该重组酶具有良好的应用前景。     

不同细胞系表达的抗EGFR单抗糖基化结构对比分析

真核表达系统造就了单克隆抗体药物的广泛异质性,这些异质性通常是由翻译后修饰引起,而糖基化修饰则是关键的翻译后修饰,其对治疗性蛋白的安全性和有效性有着深远的影响,为探索细胞表达系统的改变对单抗糖基化所带来的影响,应用液相色谱-电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱技术(LC-ESI-Q-Tof),通过交替高低碰撞能量扫描、源内诱导解离及二级质谱的方法从释放的寡聚糖水平研究聚糖结构,对比分析由两种不同细胞系制备的抗表皮生长因子受体(EGFR)单抗,然后结合外切糖苷酶逐级消化的方法对两种蛋白的糖链结构作进一步确证分析。分析结果表明,在Fc区域的糖基化修饰,两种表达系统表达的该抗体未发生明显的改变,而在Fab区域,由小鼠骨髓瘤细胞SP2/0制备的抗EGFR单抗的聚糖结构中含有大量α半乳糖(α-Gal),且末端唾液酸形式主要是N-羟乙基神经氨酸(NGNA),具有极高的免疫原性风险。而通过中国仓鼠卵巢细胞CHO表达系统制备的抗EGFR单抗Fab区域聚糖结构中不含有α-Gal,且末端唾液酸形式主要是N乙酰神经氨酸(NANA),免疫原性风险极大降低。本研究在一定程度上可以预测由CHO表达系统制备的抗EGFR单抗具备较好的临床耐受性,超敏反应发生风险低,CHO细胞可以作为该抗体改良型生物类似药(Biobetter)的优选表达系统。     

重组内肽酶AspN的原核表达纯化和活性鉴定

蛋白内肽酶AspN是一种锌金属内切肽酶,能选择性切割天冬氨酸的N端肽键,广泛应用于蛋白的多肽制备及质量肽图谱鉴定。目前内肽酶AspN来源于细菌分泌,产量低,制备困难,成本高,极大地限制了该酶的应用。将脑膜脓毒性黄杆菌分泌的蛋白内肽酶Asp N所对应的基因克隆入表达载体p ET32a,导入E.coli BL21(DE3),首次运用原核表达系统进行可溶性融合表达,亲和层析对重组蛋白进行纯化。用HPLC、SDS-PAGE和荧光底物Anthranilyl-Ala-Phe-Ala-Phe-Asp-Val-Phe(NO2)-Tyr-Asp对重组酶进行酶活鉴定。结果表明重组的内肽酶Asp N具有与标准品基本一致的酶切活性,能够较好地应用于生物和制药领域。     

LC-MS对奥马珠单抗与其生物类似物CMAB007的分析与结构特征

哮喘是当今世界威胁公共健康的最主要的慢性肺部疾病,作为治疗中重度和难治性哮喘的特效药奥马珠单抗治疗费用相对昂贵,生物类似药CMAB007的研制可以降低治疗费用。本研究用质谱分析一种奥马珠单抗生物类似药CMAB007与原研药的一致性,分别从氨基酸分析、肽图、N/C端序列,还原质谱,寡糖含量,N糖分析等层面对CMAB007和奥马珠单抗进行了系统的比对研究,为进一步临床研究打下基础。结果表明CMAB007和奥马珠单抗氨基酸序列一致,赖氨酸剪切也基本一致,带唾液酸修饰糖形和带核心岩藻糖形比例相近,高甘露糖形比例差异不大,CMAB007略低于奥马珠单抗。因此CMAB007满足生物类似药在结构比对上一致性的要求,有望成为国内首先上市的重组抗人Ig E单克隆抗体药物。     

半胱氨酸蛋白酶IdeS的原核表达、纯化及活性鉴定

酿脓链球菌来源的免疫球蛋白G降解酶 (immunoglubulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes, IdeS) 是一种典型的半胱氨酸水解酶,可以在抗体铰链区的特定位点进行酶切,使IgG水解为完整的 F(ab)₂片段和Fc片段,由于其独特的酶活特异性和高活性,IdeS可以作为工具酶应用于IgG的亚单位制备、结构分析及表征分析.利用双标签 (GST-tag及His₆-tag) 表达系统在E.coli中高效表达了可溶性重组蛋白酶GST-IdeS-His₆,并在IdeS的氨基端与GST之间加上肠激酶酶切位点,以利于标签的去除.再利用亲和层析的纯化方法对目的蛋白进行纯化.使用SDS-PAGE、HPLC-SEC、LC-MS对纯化后的IdeS进行分析和鉴定.结果表明:本系统所表达的蛋白酶IdeS得率高,每1L菌液纯化可获得约25mg纯度为90%以上的蛋白酶IdeS,将此蛋白酶与抗体IgG以1:100 (m/m) 比例混合,于37℃反应30min,即可酶切完全.能够满足蛋白质结构分析中对蛋白酶的高质量要求,并且适用于抗体类药物的表征分析.同时,蛋白酶IdeS也可以应用于生物仿制药、生物改良药和新一代抗体以及Fc-融合蛋白的研究.