人类免疫缺陷病毒Ⅰ型核心蛋白(p24)在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

在大肠杆菌中,利用新构建的含T7g-10L RBS以及λ-PR启动子的新型原核表达载体,通过表达gag-pol基因片段,获得了具有天然序列的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核心蛋白p24的高效表达。克隆的gag-pol基因片段在其阅读框架移位区域插入了4bp碱基,其表达的病毒蛋白酶在阅读框架上与gag一致,从而实现了对gag-pol融合蛋白的有效加工,产生成熟的核心蛋白p24及其它产物。重组p24以可溶形式存在,可以被抗p24的单克隆抗体特异识别。测定的N端8个氨基酸序列与从病毒纯化的p24完全一致。在使用硫酸铵沉淀后,采用两步离子柱层析,可将重组蛋白纯化到95％以上的纯度。结果表明,纯化的p24可以作为特异性很强的试剂而用于HIV感染的诊断及病情的预后,并可用于p24的生化及结构分析。     

遗传学及对生命的认识(续1)

1 克隆与拷贝DNA 在70年代早期,旧金山加利福尼亚大学的Her-bert Boyer和斯坦福大学的Stanley Cohen已经能够将取自别的细菌,尔后是无关的动植物细胞的基因插入细菌之上,使其克隆化。他们首先使用限制酶将供体DNA切割成可操作的片段。其次,他们发现如何将这些基因拼接入质粒,然后再由质粒将该DNA片段带入细菌。一旦进入细菌,新基因便随着细胞分裂而复     

人白细胞介素18的基因克隆与表达

人白细胞介素１８（ＩＬ－１８）是新近发现的细胞因子之一．研究表明它参与Ｔ１辅助细胞介导的细胞免疫．利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人外周血细胞扩增得到了ＩＬ－１８的ｃＤＮＡ并测定其核酸序列．利用基因重组技术构建ＩＬ－１８的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达．这为以后进一步研究ＩＬ－１８的功能奠定了基础．     

遗传学及对生命的认识

第一部分 基础遗传学1 何物被遗传,以及如何遗传? 牛生牛犊,不生马驹或幼狮。狗生小狗,猫生小猫。动物倾向于产生与其自身非常相像的后代。同样,两个身材高的人的后代也倾向于高身材。买一些旱金莲花的种子种在你的花园里,长出的植物倾向于同种子包装袋上的图画相似。 “倾向”一词在每种情况下都是必要的,因为某一特定动物或植物的所有属性并非都能纯一传代,或者可以清楚地从一代追踪至下一代。父母虽然都是高个,也能生出矮个的后代。除一卵双生子以外,兄弟姊妹往     

肥胖基因的分离及其在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术自外周血白细胞染色体DNA中扩增获取了肥胖基因(ob基因)的外显子2和3序列.经过拼接,获得了全长的ob基因编码序列. 测序结果表明,获得的序列与文献报道完全一致.利用PCR技术扩增出成熟蛋白的编码序列,克隆至表达载体pBV220中获得了表达菌株,并对表达产物进行了初步纯化,为进一步研究ob基因产物的功能与应用奠定了基础.     

遗传学及对生命的认识(续完)

1 孪生子研究:先天与营养 长期以来两类孪生子被用于研究,以确定遗传性和环境在特定性状和疾病的发生中究竟哪一个起决定性作用。从一个受精卵细胞分裂产生的单合子孪生子在遗传上是一致的,而分别受精的二合子的孪生子在遗传上并不比不同妊娠所生的姊妹更亲近。因此,单合孪生子与双合孪生子相比,在某一性状上具有更大     

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型Gag前体蛋白片段在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

利用新型原核表达载体pDOG,在大肠杆菌中高效表达了人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)gag基因片段。表达载体利用λPR启动子以及T7g-10的RBS来有效起始表达基因的翻译。表达片段PG1包括p17C-端13个氨基酸、整个p24以及p15N-端74个氨基酸。与PG1相比,PG2片段不含有p17序列,并缺失了p24N-端77个氨基酸。两者的表达量均占总菌体蛋白的20％以上。重组蛋白以包涵体形式存在,在提取包涵体后,经过一步离子柱层析,可以纯化到90％以上的纯度。PG1可被一株抗p24的单抗特异识别,而PG2则不能。纯化的重组蛋白能与HIV-1阳性血清发生很强的特异反应,可以用于HIV-1抗体检测中。     

人白介素6受体拮抗剂的构建及其在大肠杆菌中的表达

白介素6的过高表达往往与一些疾病的发生和发展有关,如一些自身免疫性疾病、增生性疾病和某些恶性肿瘤。这种情况下就有必要拮抗或抑制IL-6的作用以达到治疗的目的。一般来说,细胞因子的可溶性受体作为细胞因子结合蛋白(CBPs)可以拮抗相应因子的作用,但IL-6的可溶性受体(sIL-6R)却不同,它与IL-6形成的复合物仍然能与信号转导子gp130结合,介导IL-6的效应,起到IL-6激动剂的作用,因而有必要构建具拮抗效应sIL-6R的突变体分子,以用于IL-6相关疾病的治疗研究。     

链激酶基因的分离和其在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化

从化脓性链球菌的染色体ＤＮＡ分离得到的目的基因片段定向插入载体Ｐｂｖ２２０中,获得有目的基因插入的重组质粒ＰｂｖＳＫ。双脱氧链终止法手工测序和Ｂｅｃｋｍａｎ自动测序仪分析Ｒｓｋ基因的全长序列,测序结果表明我们所获得的Ｒｓｋ基因与文献报道的基本一致。重组质粒ＰｂｖＳＫ转化受体菌Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５α株,温敏诱导后表达一个分子量约４７ｋＤａ的特异蛋白,其表达量为６０％。表达产物以包涵体的形式存在,包涵体经过洗涤、溶解和纯化后,最终纯度达到９５％以上。复性的重组蛋白用体外血块溶解法测定生物活性,结果表明我们所获得的Ｒｓｋ蛋白具有较好的溶解血块的活性,其比活性为１.３×１０^５ｕ／ｍｇ。