肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EspA和EspB蛋白的重组表达及其免疫效果

目的：通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌（EHEC）0157：H7的EspA和EspB蛋白,并分析它们的免疫保护性。方法：采用PCR技术从EHEC0157：H7基因组中扩增espA和espB基因,连接至pET-22b（4-）载体上,转化至宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,用亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE测定其相对分子质量,免疫小鼠分析其免疫保护性。结果：重组espA和espB基因片段的测序结果与GenBank中的相应基因序列完全一致,一致性均为100％;得到了纯度为95％以上的重组EspA和EspB蛋白,免疫小鼠所得到的抗体效价均为10^6。结论：重组EspA和EspB蛋白获得了可溶性表达,表达的蛋白具有良好的免疫保护性,为进一步制备疫苗奠定了基础。     

从西洋参中提取分离纯化人参皂苷R_(b1)和人参皂苷R_e的研究

用大孔吸附树脂从西洋参提取物中富集西洋参总皂苷,再利用丙酮沉淀及重结晶方法获得高纯度的人参皂苷Rb1和Re.可以得到含量大于95%的人参皂苷Rb1(收率2.6%)和92%的人参皂苷Re(收率0.5%),以及纯度为98.5%的人参皂苷Rb1(收率2.0%)和97.8%的人参皂苷Re(收率0.25%).该方法简便、实用,适用于工业大生产,为进一步开发成新药奠定了基础.     

川射干化学成分的研究

研究中药川射干的化学成分.采用70%乙醇提取,硅胶柱层析分离及结晶等方法分离其化学成分,通过波谱及化学方法进行结构鉴定.分离得到9个化合物,分别是鸢尾苷(tectoridin,1)、野鸢尾苷(iridin,2)、鸢尾甲苷A(iristectorin A,3)、点地梅双糖苷(tectomside,4)、鸢尾苷元(tectorigenin,5)、鸢尾甲黄素A(ifistectori- genin A,6)、染料木素(genistein,7)、二甲基鸢尾苷元(dimethytectorigenin,8)、野鸢尾黄素(irigenin,9).其中化合物7和8为首次从该植物中分离得到.     

创新药物二乙基射干苷元的杂质研究

对抗病毒新药MJJ原料药中杂质进行研究。利用液-质联用技术检测杂质的结构,结合文献推测杂质来源。利用碱破坏MJJ制备杂质,并通过NMR等光谱技术确定结构。利用杂质反向合成MJJ,合成的杂质可作为MJJ质量控制的杂质对照品。生物活性测试结果表明,该杂质具有一定的抗肿瘤活性。该方法新颖,为原料药的杂质研究提供了良好的思路,并为创新药物MJJ的有关物质及质量控制等研究提供了有意义的试验数据和参考依据。     

高效液相色谱法测定川射干鸢尾苷元磺酸钠及其制剂泰克吉宁注射液含量和有关物质

建立高效液相色谱法测定鸢尾苷元磺酸钠(4′,5,7-三羟基-6-甲氧基异黄酮-5′-磺酸钠)及其制剂泰克吉宁注射液的含量及有关物质。采用C18色谱柱(150×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-5%醋酸水(80:20),流速为1.0mL/min,检测波长为263nm。鸢尾苷元磺酸钠在11～100μg/mL范围内线性关系良好,回归方程Y=43.3609X-1.5973(r=0.99998),平均回收率为99.77%(n=9)。最低检测限为0.052μg/mL,与有关物质分离良好。本法快速、简便、准确,专属性强。     

B型肉毒毒素轻链的高效制备及活性鉴定

目的:在大肠杆菌中高效表达B型肉毒毒素轻链(BoNT/BLC)并纯化,研究其生物学活性。方法:根据报道的BoNT/B LC基因序列设计引物,从肉毒梭菌中扩增BoNT/BLC基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-22b中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta感受态细胞,构建重组大肠杆菌pET-22b BoNT/BLC/BL21(DE3)Rosetta,在20℃条件下用IPTG诱导目的蛋白表达,表达产物经His Trap FF柱纯化,用SDS-PAGE对目的蛋白进行鉴定,并利用相应底物对纯化产物进行生物活性分析。结果与结论:构建了重组大肠杆菌pET-22b BoNT/BLC/BL21(DE3)Rosetta,BoNT/BLC表达量达到了细菌总蛋白的30%左右,通过一步亲和纯化目的蛋白后经SDS-PAGE检测其纯度在95%以上,制备的重组LC的酶活略高于B型肉毒毒素全毒素,可作为试剂用于BoNT/BLC抑制剂高通量体外检测方法的研究。     

超高效液相色谱法同时测定川射干中7个异黄酮成分的含量

分析测定不同产地的川射干中射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾苷元、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B 7个异黄酮成分,建立快速测定其异黄酮成分含量的方法。采用Waters Acquity UPLC系统;色谱柱为Waters BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm);流动相为乙腈-0.5%冰醋酸,梯度洗脱;流速0.5 m L/min;柱温:35℃;检测波长266 nm。所得结果表明川射干中异黄酮成分分离良好,各成分进样量与峰面积在测定范围内呈现良好的线性关系(r≥0.9990),加样回收率分别为99.68%、100.57%、98.43%、98.03%、99.14%、97.53%、101.86%,RSD分别为0.84%、1.82%、1.67%、1.54%、0.89%、1.95%、1.77%。本实验所建立的川射干UPLC含量测定方法快速、简便、准确,为川射干的质量控制提供了科学依据。     

RP-HPLC法测定葫芦巴中葫芦巴皂苷B的含量

本文采用Kromasil C18(250×4.6 mm,5μm),乙腈-0.2%磷酸溶液(83:17)为流动相,流速1.0 mL/min,DAD检测器,检测波长203 nm,对葫芦巴中葫芦巴皂苷B含量进行测定,能将葫芦巴皂苷B与杂质分开,葫芦巴皂苷B在1.60~11.20μg范围内峰面积与其浓度线性关系良好(R=0.99996),样品的平均加样回收率为99.83%,RSD为1.47%(n=6)。该法测定样品快速准确,重现性好。     

肠出血性大肠杆菌毒力相关基因突变株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、espB、espD,构建3株突变株。方法:以肠出血性大肠杆菌O157∶H7为模板,PCR扩增基因两翼的同源序列;将PCR产物插入pEASY-T1载体并测序,将测序正确的上、下游同源序列分步酶切,构建于pUC19-kan质粒上,经PCR获得两端同源序列中间嵌合卡那霉素抗性基因标记的线性片段,利用质粒pKD46介导的重组技术,敲除espA、espB、espD基因,之后转入pCP20质粒以去除抗性标记,最后测定突变株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、es pB、espD,获得3株突变株,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:为进一步研究espA、espB、espD基因在肠出血性大肠杆菌O157∶H7致病过程中的作用奠定了基础。     

一种来源于蜘蛛毒液的新型Nav1.7多肽抑制剂的发现与鉴定

Nav1.7特异性地表达在外周伤害性感觉神经元。临床遗传学、动物模型和药理学研究表明，Nav1.7是一个重要的镇痛药物开发靶点。本研究以沟纹硬皮地蛛（Calommata signata Karsch）毒液为研究对象，通过电刺激采集毒液、反相高效液相色谱分离纯化、质谱鉴定、蛋白质测序以及全细胞膜片钳记录等方法，筛选并鉴定到一种对Nav1.7有抑制作用的新型多肽毒素，命名为APTX-1。质谱鉴定该多肽毒素的分子质量为7 815.2 Da；其N端前10位氨基酸序列为ASCKQVGEEC。APTX-1抑制Nav1.7电流具有浓度依赖性，其半数抑制浓度为（0.46±0.08）μmol/L。通道动力学分析显示，APTX-1并不影响Nav1.7的翻转电位、电压依赖性稳态激活曲线和失活曲线，表明该多肽毒素并不影响Nav1.7的离子选择性和电压依赖性。综上所述，本研究获得了一个新型Nav1.7调制剂，并探究了其对Nav1.7的作用特点，为靶向Nav1.7的镇痛药物研发提供了潜在先导分子。