蓖麻毒素与其单克隆抗体相互作用动力学研究

表面等离子体激元共振(SPR)是一种可微量、实时、动态地监测生物分子相互作用的生物传感技术。蓖麻毒素为核糖体失活蛋白,具有很强的细胞毒性作用。通过SPR技术研究了两种抗蓖麻毒素的单克隆抗体C5、D12与蓖麻毒素相互作用的动力学,计算出两者的亲和常数分别为2.49×108mol-1·L和7.9×108mol-1·L,并对两种抗体的抗原表位进行了分析。     

核内小RNA与反义RNA

长期以来,人们认为RNA 只是DNA性 状表达过程中的中间环节,RNA的功能在于控 制蛋白质的生物合成,因此,研究主要限于参与 蛋白质生物合成的tRNA, rRNA和mRNA o然 而,近年已经证明RNA具有生物催化活性,可 以控制DNA的复制,还是染色体的结构成分。 由于RNA分子的种类很多,可能具有多种生 物功能。极为引人注目的是,它们对基因表达可 能有重要的调节作用。目前这方面的研究仅属 开始,现就以下几方面作一简单介绍     

应用PCR重组技术构建大肠杆菌分泌型表达载体

应用ＰＣＲ重组技术,对大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－ⅢｏｍｐＡ进行改建,除去原载体的ＨｉｎｄⅢ位点,将信号肽序列末端两个密码子ＣＡＧＧＣＣ改为ＣＡＡＧＣＴ,从而引入一个新的ＨｉｎｄⅢ位点,并在其下游接上一段多克隆位点序列。改建后的载体可用于直接插入外源ＤＮＡ编码序列,表达产物在分泌过程中被切除信号肽而成为天然有活性的蛋白质,操作十分简便。     

丝状噬菌体与噬菌体展示技术

丝状噬菌体的利用,在分子生物学研究以及基因工程发展中起了重大作用[1]。丝状噬菌体作为载体具有多方面的巨大应用潜力。1985年Smith[2]到最先将外源基因插入丝状噬菌体fl的基因Ⅲ,使目的基因编码的多肽能以融合蛋白的形式展水在噬菌体表面,从而创建了噬菌体展示技术。噬菌     

新型溶栓剂葡萄球菌激酶的研究进展

本综述从葡激酶的溶栓作用机制,包括与纤溶酶(原)等因子的结合与作用,葡激酶的高级结构,抗原性问题等方面概括了近年来有关葡激酶作为亲一代溶栓剂的研究成果,并指出进一步利用蛋白质工程,对葡激酶进行分子改造的设想。     

轮换淘选法筛选凝血酶特异的噬菌体抗体

以抗原为选择剂,通过淘选可以从噬菌体抗体库中获得特异的单链抗体克隆。采用液相一固相轮换淘选的方法,从鼠源噬菌体抗体库中淘选出与凝血酶特异结合的单链抗体。首先,用光敏生物素将凝血酶生物素化,然后用链亲和素磁珠法淘选与凝血酶特异结合的重组噬菌体。噬菌体扩增后使用酶标板进行第2轮淘选,以除去上一轮中非特异结合的重组噬菌体。经4轮轮换淘选,最后从23个单克隆噬菌体抗体中分离出4个凝血酶特异的噬菌体抗体。     

水蛭素在噬菌体表面的展示

水蛭素是凝血酶强有力的天然抑制剂。通过改造噬菌质粒并构建水蛭素表达载体pCANTAB 5G8Hir,使水蛭素基因通过接头与噬菌体M13的gp3(197～406)基因片段融合。表达产物在gp8信号肽的引导下到达大肠杆菌周质,在辅助噬菌体M13KO7的帮助下组装到丝状噬菌体外壳上。展示在噬菌体表面的水蛭素仍然具有与凝血酶结合并抑制酶活性的作用,说明展示的水蛭素保持了正确的空间构象和生物学活性。水蛭素在噬菌体表面的功成展示为进一步开展其实验定向进化以及结构与功能关系的研究打下基础。     

从噬菌体抗体库中淘选血纤维蛋白特异的单链抗体

为构建小鼠噬菌体抗体库 ,以获得对人血纤维蛋白特异的抗体 ,由小鼠脾脏提取 m RNA,经反转录 PCR扩增出抗体重链、轻链可变区基因片段 ,将二者和一段编码十五肽 (Gly4 Ser) 3的 DNA接头借助重组 PCR组装成为单链抗体 (single- chain antibody,Sc Ab)基因 .将单链抗体基因插入噬菌体展示载体 p CANTAB- 5E,通过电击法转化大肠杆菌 TG1细胞 ,用辅助噬菌体 M1 3K0 7超感染 ,构建了库容量在 1 0 8以上的噬菌体单链抗体库 .利用亲和选择方法 (淘选 ) ,从噬菌体抗体库中选得血纤维蛋白特异的单链抗体 .模拟抗体成熟过程 ,用 DNA改组 (DNA shuffling)技术使抗体基因重新组合 ,构建新的改组抗体库 ,并从中选择到提高了亲和力的噬菌体单链抗体 .抗体基因在大肠杆菌中表达 ,表达蛋白经 Sephadex G- 75柱层析分离 ,得到初步纯化的单链抗体蛋白 .     

DNA改组技术在水蛭素实验进化中的应用

蛋白质的改造是生物工程的重大研究课题.由于结构和功能预测的不精确性,而使按照三维结构信息进行定位诱变往往达不到预期的目的.近年来,另一条改造蛋白质的途径有较大的发展,即在实验室条件下模拟生物分子的自然进化,通过变异和靶功能的选择来获得改进性能的蛋白质[1],此过程称为生物分子实验定向进化.DNA改组(DNAshuffling)是一种改造基因和蛋白质的有效实验进化技术[2].它是在体外进行基因随机片段的重组,从而增加基因的多样性,促使有利变异与不利变异分离,通过选择使有利变异得到优化组合[3].DNA改组包含3个步骤:基因的随机片段化,自身引发PCR和重组合PCR.经过DNA改组的突变体库有可能选择到性能更优的突变体.为进行亲和淘选,需将突变体展示在噬菌体的表面[4].