SARS—CoVSars7a和EGFP融合蛋白真核表达载体构建及其表达

根据SARS-CoV sars7a基因设计并化学合成部分重叠引物,经二轮PCR获得sars7a基因片段,以此片段为模板并利用一对带有Kozak序列及删除终止密码的引物进行PCR,获得产物与pEGFP-N1载体连接,使sars7a基因位于．EGFP的基因上游,得到含编码Sars7a-EGFP融合蛋白基因的哺乳动物细胞表达载体。采用细胞核转染技术将重组表达载体转染K562细胞,以流式细胞仪和共聚焦显微镜分析,可检测到EGFP的绿色荧光,表明Sars7a—EGFP得到表达,该蛋白分布于整个细胞,提示Sars7a并非膜蛋白,更可能是胞浆蛋白。此外,该蛋白的表达对K562细胞凋亡无明显影响。     

SARS-CoV Sars7a和EGFP融合蛋白真核表达载体构建及其表达

根据SARS-CoV sars7a基因设计并化学合成部分重叠引物,经二轮PCR获得sars7a基因片段,以此片段为模板并利用一对带有Kozak序列及删除终止密码的引物进行PCR,获得产物与pEGFP-N1载体连接,使sars7a基因位于EGFP的基因上游,得到含编码Sars7a-EGFP融合蛋白基因的哺乳动物细胞表达载体.采用细胞核转染技术将重组表达载体转染K562细胞,以流式细胞仪和共聚焦显微镜分析,可检测到EGFP的绿色荧光,表明Sars7a-EGFP得到表达,该蛋白分布于整个细胞,提示Sars7a并非膜蛋白,更可能是胞浆蛋白.此外,该蛋白的表达对K562细胞凋亡无明显影响.     

SARS- CoV X4 基因转染对T 细胞 TNF- A及IL- 6 分泌的影响

目的：通过检测SARS-CoV X4基因转染后T细胞细胞因子分泌的变化,研究SARS-CoV X4蛋白潜在的功能及其作用机制,并探讨其与SARS-CoV致病机制的关系。方法：利用RosetteSep分离法分离外周血T细胞,以Amaxa核转染仪将pEGFP-SARS-CoV X4真核表达载体转入T细胞,应用激光共聚焦显微镜观察其瞬时表达情况,流式细胞仪检测转染效率,CBA技术检测T细胞细胞因子。结果：SARS-CoV X4基因转染后12h得到了明显表达,共聚焦显微镜观察到EGFP绿色荧光表达,流式细胞仪检测其表达率为245;与空载体转染组相比,SARS-CoV X4基因转染能显著促进T细胞IL-6及TNF-α的分泌。结论：SARS-CoV X4蛋白可诱导T细胞分泌前炎症因子IL-6及TNT-α,SARS-CoV X4蛋白可能在SARS发病机制中起重要的作用。     

Jagged 1与Delta1对树突状细胞的影响

Jagged 1与Delta1是Notch信号通路中的两个配体,近来研究表明,它们能影响树突状细胞的分化和成熟,并通过树突状细胞等抗原提呈细胞介导T辅助细胞的不同分化,可能为免疫性疾病的临床治疗提供新的药物靶点.     

α-SMA在培养生长板软骨细胞中的表达

目的探讨α-SMA在原代培养生长板软骨细胞中的表达及传代培养对其表达的影响。方法分离、培养大鼠肋生长板软骨细胞(rat costochondral growth plate chondrocyte,RGC),免疫细胞化学(ICC)和Western blot分别对1-5代RGC中α-SMA的表达进行定性和半定量分析。结果原代培养的RGC不表达α-SMA,随着传代次数的增加,α-SMA阳性染色的细胞比例从原代的0增加到第5代的24.2±4.3%(n=3),Western blot结果与ICC结果一致。结论本研究首次发现原代培养的RGC并不表达α-SMA,随着RGC传代次数的增加,表达α-SMA的细胞比例和表达量不断升高。     

人β2-微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

β₂-微球蛋白(β₂m)是主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子的轻链部分, 为制备MHC-Ⅰ类分子四聚体的必要成分。 根据已报道的序列设计特异引物, 利用RT-PCR方法从人白细胞中克隆了β₂m基因, 并构建了成熟β₂m的原核表达载体, 在大肠杆菌中得到高效表达。 表达的β₂m大部分在包涵体中,经洗涤、变性和复性,并以强阴离子交换柱层析纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β₂m,Western印迹法分析表明该蛋白具有与抗人天然β₂m抗体反应的特性。此工作为制备MHC-Ⅰ类分子四聚体奠定基础。     

Jagged1在树突状细胞诱导免疫耐受中的作用

Jagged1是Notch信号通路中的一个配体,近来许多研究表明,它能诱导树突状细胞的成熟,并通过促使T淋巴细胞分化成调节性T细胞或II型T辅助细胞,从而诱导免疫耐受。     

喘可治注射液对小鼠体外CD4+CD25+T细胞的影响

利用荧光抗体标记和流式细胞术检测喘可治对刀豆蛋白A(ConA)诱导的T细胞CD69和CD25表达的影响,研究喘可治是否具有促进CD4 CD25 调节性T细胞升高的作用.结果发现喘可治对ConA诱导的T细胞活化标志分子CD69的表达具有抑制作用,但对CD25的表达具有促进作用.说明喘可治对T细胞活化具有抑制作用,CD25表达的上调并不是由活化引起的,而很可能是CD4 CD25 Tr水平升高的标志.     

胸腺细胞和细胞器水平的线粒体膜电势研究

以地塞米松(DEX)诱导小鼠胸腺细胞凋亡;利用PI和AnneXin V/PI流式细胞术分别检测细胞晚期和早期凋亡;利用JC-1和DiOC_6(3)/PI在细胞水平检测凋亡中线粒体膜电势(△ψm)变化：抽提线粒体,利用JC-1直接染色技术检测现存线粒体△ψm情况。实验结果显示,DEX显著诱导胸腺细胞早期和晚期凋亡,凋亡细胞主要来自G_0/G_1期;细胞水平可见DEX介导与△ψm相关的J-aggregate和DiOC_6(3)可染性降低,同时介导线粒体数量显著降低,6h细胞膜完整性无显著变化：单纯线粒体检测结果显示,多数线粒体维持正常△ψm。提示,DEX介导胸腺细胞凋亡中线粒体数量降低,现存线粒体多保持着正常△ψm以维持凋亡过程细胞能量供给。     

早、中、晚孕期胎盘因子体外抗HIV-1的研究

目的:探讨早、中、晚孕期胎盘因子(PF)体外抗人免疫缺陷病毒-1(HTV-1)的作用及其在HIV-1垂直传播中可能的作用.方法:采用荧光染料Calcien-AM标记的H9/HIV-1 ⅢB分别与早、中、晚孕期不同稀释浓度的PF作用后,与MT2细胞混合培养,荧光显微镜下观察合胞体的形成;用游离的HIV-1 ⅢB感染MT2细胞,并分别与早、中、晚孕期不同稀释浓度的PF作用后,用MTT法检测HW-1感染细胞的存活率,用HIV-1 p24抗原试剂盒检测细胞培养上清中p24抗原含量的变化.结果:各孕期PF并不能抑制MT2和H9/HIV-1 ⅢB细胞的融合,但可以增加HIV-1感染细胞的存活率及减少HIV-1 p24抗原的表达,且效应以早孕期PF最大,中孕期PF其次,晚孕期PF最小,并与剂量呈正相关.结论:PF在体外具有抗HIV-1的作用,并呈现孕期和剂量相关性,可能在阻断HIV-1垂直传播中具有一定作用.