转录激活因子样效应物核酸酶介导的山羊β-乳球蛋白基因敲除和人乳铁蛋白基因定点整合

为了敲除山羊乳中致敏源β-乳球蛋白(BLG)基因,同时在BLG基因座定点整合人乳铁蛋白(hLF)基因。首先针对山羊BLG第3外显子识别位点设计了1对特异性TALEN-3-L/R质粒对;同时,构建了含有1个HSV-TK负筛选基因的hLF基因打靶载体BLC14-TK。TALENs质粒对转染山羊胎儿成纤维细胞,2μg/m L嘌呤霉素筛选3 d,PCR扩增产物测序来验证其切割DNA活性。打靶载体BLC14-TK与TALEN-3-L/R质粒对共转染山羊胎儿成纤维细胞,经700μg/m L G418和2μg/m L GCV共筛选药物抗性细胞株;通过整合检测和同源重组检测来筛选hLF基因打靶细胞株;BLG~–/hLF~+打靶细胞株作为供核细胞进行山羊体细胞核移植。结果为:TALEN-3-L/R致突变率为25%-30%;获得BLG~–/hLF~+打靶细胞6株;共制作重构胚胎335枚,移植受体山羊23只,B超检测到30-35 d的妊娠受体9只(妊娠率39.1%),其中1只50日龄克隆胎儿验证为BLG~–/hLF~+基因型。以上结果表明获得BLG基因座定点整合hLF基因的基因打靶山羊是可行的,为培育羊乳中含低致敏原和富含hLF的山羊新品系奠定了基础。     

血红素加氧酶介导GA对小麦糊粉层中α-淀粉酶的诱导表达

单独以赤霉素（GA）处理或与HO．1诱导物高铁血红素（Ht）和CO水溶液组合处理均导致小麦糊粉层中血红素加氧酶（H0）活性的提高,同时仪-淀粉酶基因表达和α-淀粉酶活性也明显受诱导;用HO-1专一性抑制剂锌原卟啉（ZnPPIX）预处理6h后,上述效应部分受阻断。这暗示HO可能参与GA诱导的α-淀粉酶基因表达。     

一个新的忽地笑O-甲基转移酶基因的克隆与原核表达

采用RACE技术克隆得到一个新的忽地笑O-甲基转移酶（OMT）基因,命名为LaOMT。LaOMT的cDNA序列为1379 bp,开放阅读框1077 bp,预测编码蛋白包含358个氨基酸。序列比对分析发现, LaOMT编码的蛋白序列具有依赖于S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的高度保守的结构域,与葡萄、大豆等其他植物OMTs蛋白的相似性为50%左右。将LaOMT基因连接到原核表达载体pET28a上,转化大肠杆菌Rosetta （DE3）的SDS-PAGE电泳结果显示,重组蛋白受异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,分子量大小约为45 kDa,与已报导的其他植物的OMTs蛋白大小基本一致。此外,半定量RT-PCR分析结果表明, LaOMT在忽地笑的叶、鳞茎、根和花中均有表达,其中花中的表达量最低。     

外源一氧化碳对盐胁迫下水稻悬浮细胞死亡的缓解效应

水稻悬浮细胞经NaCl（0～400mmol·L-1）处理后,细胞死亡率随着NaCl浓度的增大和处理时间的延长而上升。50%饱和度的外源一氧化碳（CO）溶液预处理3h可以缓解随后由200mmol·L-1NaCl引起的细胞死亡率上升,CO清除剂血红蛋白（Hb）有逆转CO的保护效应。CO在不同程度上还可以促进超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的上升或相应基因的表达。     

植物血红素加氧酶研究进展

本文综述了血红素加氧酶（HO）的催化机理、结构特征、遗传学突变体以及在光敏色素发色团合成、调控根形态发生和参与植物对非生物胁迫应答中的作用及信号转导。同时,介绍了紫外线和盐胁迫等逆境条件以及生长素和脱落酸等植物激素对HO基因表达调控等方面的研究进展。     

换锦花和中国石蒜对干旱胁迫的生理响应

以2种春出叶石蒜属植物中国石蒜和换锦花为材料,通过盆栽控水试验,以适宜水分(最大持水量的75%~80%)为对照,设置干旱胁迫(最大持水量的35%~40%)处理,研究干旱胁迫对其幼苗生理生化指标的影响,以明确2种植物的耐旱特性。结果显示:(1)换锦花和中国石蒜幼苗叶片相对含水量(RWC)和叶绿素a、b含量均随着干旱胁迫时间的延长而降低。(2)换锦花可溶性糖含量和脯氨酸含量均随着干旱时间的延长表现出持续增加的趋势,而中国石蒜则表现出先升高后降低的趋势。(3)换锦花和中国石蒜幼苗叶片TBARS含量和相对电导率总体上呈增大趋势,并在干旱末期达到最大值;超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性均呈现出先上升后下降趋势。(4)换锦花和中国石蒜幼苗叶片净光合速率(Pn)、胞内二氧化碳浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)随着干旱胁迫时间延长均有不同程度下降。研究表明,在土壤干旱胁迫条件下,换锦花和中国石蒜幼苗叶片在水分生理、光合特性、渗透调节物质和抗氧化酶活性等方面表现出一定的差异,其中换锦花较中国石蒜表现出较强的耐旱性,且具有明显的优势。     

外源一氧化碳对铁胁迫下的离体水稻叶片氧化伤害的缓解作用

不同饱和度的外源CO水溶液预处理离体水稻叶片,可以浓度依赖性地缓解铁胁迫引起的硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）含量的上升,并诱导铁蛋白基因表达。此外,50%饱和度的CO水溶液还能不同程度地逆转由于柠檬酸铁胁迫引起的叶中抗坏血酸过氧化物酶（APX）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的上升。     

石蒜LrP5CS基因的克隆与表达特性分析

Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物渗透胁迫下谷氨酸途径合成脯氨酸的关键酶。该研究以石蒜(Lycoris radiata)为材料,采用同源克隆、RACE方法结合RT-PCR技术克隆获得LrP5CS基因全长cDNA序列。序列分析表明,LrP5CS基因全长2 521bp,其中开放阅读框(ORF)为2 139bp,编码713个氨基酸,预测编码蛋白质的分子量为77.19kD,等电点为6.34;LrP5CS是1个稳定的疏水蛋白,不含信号肽,不具有跨膜结构,具有AAK超基因家族和ALDH-SF超基因家族的保守结构域。氨基酸序列比对和系统进化树分析发现,LrP5CS与植物其他P5CS蛋白具有较高的一致性,且与海枣PdP5CS及油棕EgP5CS聚为一类,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明,LrP5CS在根、鳞茎和叶片中均有表达,其中在鳞茎中的表达量最高。LrP5CS在20%聚乙二醇(PEG)处理下的表达模式分析发现,LrP5CS受PEG胁迫处理的诱导表达,其基因相对表达量在处理后6h达到最高;随着处理时间的延长,LrP5CS基因相对表达量水平逐渐下调至对照水平。将LrP5CS连接到表达载体pET-28a上,转化获得LrP5CS编码基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物发现成功表达目的蛋白。该研究结果为进一步分析LrP5CS基因功能及石蒜抗逆分子育种奠定了基础。     

干旱胁迫下外源氯化钙、水杨酸和一氧化氮对石蒜抗旱性的影响

通过盆栽试验,研究了外源氯化钙（CaCl2）、水杨酸（SA）和NO供体硝普钠（SNP）处理对干旱胁迫下石蒜抗旱性的影响。结果表明,较低浓度的CaCl2对石蒜抗旱性的影响不显著,而随着CaCl2预处理浓度的提高,石蒜的抗旱效果显著增强。较低浓度SA和sNP可显著提高石蒜的抗旱性,而高浓度则会发生毒害作用。利用模糊隶属函数法综合评价渗透调节物质、膜系统和抗氧化酶活性多项指标可以得出,喷施10mmol·L—CaCl2、2mmol-L。SA和0．5mmol·L-1 SNP对石蒜抗旱性的提高具有显著效果。     

忽地笑酌-生育酚甲基转移酶基因LaTMT的克隆与表达分析

采用RACE技术从忽地笑也Lycoris aurea ( L'Hér.) Herb.页叶片中克隆获得γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因,命名为LaTMT。序列分析结果显示：该基因cDNA全长1458 bp,其中开放阅读框( ORF)长1017 bp,编码338个氨基酸残基。 LaTMT基因编码蛋白质的理论相对分子质量37560,理论等电点pI 8.70,为亲水性蛋白,无跨膜结构但具有信号肽结构;并具有S-腺苷甲硫氨酸( SAM)甲基转移酶保守结构域,包含3个SAM结合位点;该蛋白的二级结构中包含44.08%的α-螺旋、32.84%的无规则卷曲、12.72%的延伸链和10.36%的β-转角。序列比对和系统进化树分析结果显示：LaTMT蛋白属于S-腺苷甲硫氨酸-依赖性γ-生育酚甲基转移酶家族,与其他植物γ-TMT蛋白的一致性为64%~75%;在 NJ系统树上, LaTMT蛋白与单子叶植物γ-TMT蛋白聚为同一大类,并与油棕( Elaeis guineensis Jacq.) EgTMT和美洲油棕也Elaeis oleifera ( Kunth) Cortés页EoTMT聚为同一类,亲缘关系最近。基因表达分析结果显示：LaTMT基因可在大肠杆菌中成功表达,且表达量随异丙基硫代半乳糖苷( IPTG)诱导时间的延长而增加;在忽地笑的根、叶片、花苞、子房、雄蕊、花瓣和鳞茎中LaTMT基因均可表达,其中在叶片中的相对表达量最高,在子房、雄蕊和鳞茎中的相对表达量相对较低,具有明显的组织特异性。研究结果表明：忽地笑LaTMT基因在进化过程中具有很高的保守性;该基因主要定位于叶绿体中,并与忽地笑对非生物逆境胁迫的抗性相关。