丙型肝炎病毒RNA打点杂交检测方法同RT－PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针,建立了用打点杂交（ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法,同采用ＨＣＶ基因组５’端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法相比较,发现两种方法都能快速早期和特异地检出血清中ＨＣＶＲＮＡ,但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断,可采用这两种方法。这两种方法的敏感性在很大程度上依赖于引物和探针的敏感性,以及ＲＮＡ提取方法。ＲＴ－ＰＣＲ法适用于诊断病毒血症和复制,打点杂交法适用于研究ＨＣＶＲＮＡ量的变化,对治疗的评价,以及为实验筛选较高滴度的ＨＣＶＲＮＡ阳性样本。     

水痘-带状疱疹病毒ORF43蛋白的单克隆抗体制备及初步研究

水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)是引起水痘和带状疱疹这两种临床表现不同病症的共同致病原,其基因组中ORF43是VZV在宿主细胞中复制的必需基因,但目前尚无针对VZV ORF43编码蛋白性质与功能的研究报道.本研究目的 是制备抗VZV ORF43单克隆抗体,以初步研究该蛋白在细胞内的表达与分布情况.本研究构建了VZV ORF43蛋白的原核表达质粒并在大肠杆菌中进行了该蛋白的表达,纯化蛋白免疫小鼠后,使用杂交瘤技术及克隆化筛选,获得一株特异性强、反应性好的抗VZV ORF43单克隆抗体2D3.本研究使用该抗体鉴定出VZV ORF43蛋白在质粒转染细胞与病毒感染细胞中表达的分子量大小均约为70kD,但分别呈现出细胞质和细胞核的不同亚细胞定位.以上工作为后续进一步探究该蛋白在VZV感染与致病过程中的作用奠定了基础.     

细胞穿膜肽研究应用的新进展

细胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides,CPPs)是一类能够穿过细胞膜或组织屏障的短肽。CPPs可通过内吞和直接穿透等机制运载蛋白质、RNA、DNA等生物大分子进入细胞内发挥其效应功能。相比于其他非天然的化学分子,CPPs具有生物相容性佳、对细胞造成的毒性小、完成入胞转运后可降解、并能与生物活性蛋白直接融合重组表达等优点,因此成为以胞内分子为靶标的药物递送技术发展的重要工具,并在生物医学研究领域具有良好的应用前景。文中针对CPPs的分类特点、入胞转运机制及其治疗应用的新近研究进展进行综述和讨论。     

乙型肝炎病毒体外感染和复制的细胞模型

慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是严重威胁人类生命健康的世界性公共卫生问题。基于现有抗HBV药物的治疗策略,仅能在极少部分患者中实现慢性乙肝的功能性治愈。发展更为有效的抗HBV药物,需要更加透彻全面地认识各个病毒组分和关键宿主因子在HBV感染和复制生命周期中发挥的功能和机制,并在此基础上发现鉴定新的治疗靶点。支持HBV体外感染和复制的细胞模型,是研究HBV生活史的重要工具,并在治疗新靶点的发现和候选药物功效评估等研究工作中发挥关键作用。本文对支持HBV感染和复制细胞模型的新近研究进展进行梳理分析,并对这些模型的应用特点和局限性、新近研究进展和未来发展方向进行系统阐述和讨论。     

一种定量检测人血清高敏C反应蛋白的化学发光免疫方法

旨在建立一种可定量检测人血清高敏CRP的化学发光检测方法 (High-sensitivity C-reactive protein quantifiable chemiluminescent immunoassay,hs-CRP CLIA)。首先利用亲和层析和离子交换层析技术从肝硬化病人腹水中纯化出高纯度的天然CRP作为免疫原制备了22株CRP单克隆抗体 (单抗),其中13株单抗在磷酸胆碱配体捕获ELISA中呈阳性,然后利用方正滴定法筛选出单抗10C5和10C11建立了hs-CRP CLIA。试剂盒评估结果显示：该方法对血清中干扰物质IgG、血红蛋白、甘油三酯等无非特异性反应;该方法检测灵敏度高,在0.04~20.38 mg/L范围内定量检测人血清CRP标准品呈良好线性关系 (R2＞0.993);该方法准确性高、可重复性好,平均回收率为99％,批内差为4.2％~5.8％,批间差为9.0％~11.5％;该方法与进口商品化高敏CRP ELISA试剂盒平行比较检测90份血清标本,结果显示两者有良好的可比性 (r=0.968)。综上,建立的hs-CRP CLIA是一种准确、可靠、可定量的高灵敏C反应蛋白检测方法,该方法的临床应用,有利于改善我国心脏病风险评估及肠炎性疾病预后判断。     

戊肝病毒Th表位肽免疫可增强其载体蛋白的体液免疫应答

戊型肝炎病毒衣壳蛋白内包含一个强H-2^d限制性Th表位P34。以该表位肽免疫BALB/c鼠,其脾细胞能够在体外识别重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白,剔除实验表明应答细胞几乎完全是CD4⁺ T细胞,证明P34表位肽能有效诱导产生特异性Th细胞。以P34肽初免小鼠,再以包含该表位的重组戊型肝炎病毒抗原（E2）免疫,结果表明,10μg、 20μg E2免疫组在免疫后第1周即有部分小鼠产生抗体,到第3周所有小鼠均能够产生抗体;而对照肽P18初免的小鼠,以20μg E2加强免疫亦无法诱导小鼠产生抗体。这表明,Th表位肽P34初免诱导产生的Th细胞能够有效促进小鼠对携带该表位的载体蛋白的体液免疫应答。     

一株抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的广谱中和活性

以H5N1禽流感病毒株Ck/HK/Yu22/02作为抗原,应用常规杂交瘤技术和血凝抑制实验筛选出抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单抗8H5,单抗8H5经免疫荧光鉴定具有很好的H5特异性.选择33株2002～2006年不同地域,不同宿主中分离的不同遗传变异亚系的H5N1病毒代表株,对单抗8H5分别进行血凝抑制实验及中和试验分析,结果显示单抗8H5对所有H5亚型病毒均有较强反应,而对非H5亚型标准病毒株均不反应,说明8H5是一株广谱性抗H5特异性中和单抗,并提示单抗8H5的HA识别表位可能是一个相当保守的中和表位.并且单抗8H5双抗夹心系统的初步评价显示了其在诊断应用上的前景.     

器官移植病人戊型肝炎病毒慢性化感染及治疗

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染引起的急性病毒性肝炎,其发病率居急性病毒性肝炎之首。戊型肝炎通常呈急性感染病程,2008年以来陆续发现器官移植病人等免疫抑制患者感染HEV后可能迁延为慢性化。在无抗病毒药物治疗的情况下,器官移植病人感染HEV后迁延为慢性感染的比例超过60%,其中10%的病人慢性感染HEV后可能出现肝纤维化,并且在较短的时间内进展为失代偿性肝硬化导致死亡。本文简要综述器官移植病人HEV慢性化感染及治疗。     

血清miR-21 及AFP 在大鼠肝癌发生过程中的动态表达比较分析

目的:分析血清miR-21在肝癌发生过程中的表达水平并将其与传统肝癌血清标志物甲胎蛋白(AFP)比较,探索其成为肝癌早期诊断血清标志物的可能性。方法:二乙基亚硝胺(DENA)腹腔注射诱导建立大鼠肝癌模型,建模过程中收集造癌各个阶段的血清。Realtime-PCR检测血清miR-21的表达情况,ELISA法检测血清AFP水平。结果:与正常组及纤维化期大鼠相比,miR-21在肝硬化期、肝癌早期、肝癌晚期的大鼠血清均有不同程度上调(P<0.05),AFP在肝癌早、晚期的大鼠血清明显上调(P<0.05);与肝硬化期大鼠比较,肝癌早、晚期大鼠体内的miR-21表达显著上调(P<0.05),AFP在肝癌早期、肝癌晚期均显著上调(P<0.05)。结论:血清miR-21参与了肝癌发生的过程,对于肝癌发生的各个阶段均有很大的指示作用,可能作为肝癌预防和早期诊断的一个潜在标志物。     

高致病性H5亚型禽流行性感冒病毒血凝素单克隆抗体的制备与初步应用

以禽流感病毒株Ck/HK/Yu22/02（H5N1）作为免疫原,利用常规杂交瘤技术和血凝抑制试验法成功地筛选出6株稳定分泌抗高致病性H5亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体（单抗）,分别命名为2F2、3C8、3FC1、7C6、10HD4和13G4.经血凝抑制试验法分析,结果发现这6株单抗具有特异性高、反应性强、识别谱宽且互补等特点.基于单抗2F2,初步建立了三种H5N1病毒诊断方法,经评估证实均具有很好的特异性.由此说明,研究制备的抗H5亚型禽流感病毒血凝素单抗可适用于H5N1病毒的诊断.