乙脑/登革4型嵌合病毒的构建及其小鼠神经毒力测定

目的构建以乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)疫苗株SA14-14-2为基因骨架的乙脑/登革4型嵌合病毒,并分析该嵌合病毒对小鼠的神经毒力。方法通过重叠PCR方法扩增含有登革病毒4型(DENV-4)H241株pr ME基因序列和乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的NS1蛋白前177个核苷酸的融合片段,用Nar I和Bgl II双酶切后替换乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2全长克隆中的相应区域,构建成乙脑/登革4型嵌合全长克隆,通过体外转录和转染BHK21细胞获得嵌合病毒(JEV/DENV-4 chimeric virus,JD4)。通过测定嵌合病毒JD4和2个母本株JEV SA14-14-2株及DENV-4 H241株蚀斑大小、小鼠脑内神经毒力和皮下感染入脑能力、乳鼠脑内神经毒力,比较JD4和母本株之间的差异。通过将JD4在原代地鼠肾(primary hamster kidney,PHK)细胞传代30次,分析传代后嵌合病毒的神经毒力是否减弱及减弱的程度。结果测序结果表明,构建的嵌合病毒JD4基因组序列和预期一致,没有产生新的位点突变。JD4蚀斑较SA14-14-2明显偏小,但和DENV-4 H241株没有明显区别。JD4对3周龄小鼠具有较强的脑内神经毒力,和母本株DENV-4 H241没有差异,对小鼠没有神经侵袭力。乳鼠实验结果表明,嵌合病毒JD4脑内神经毒力虽然略低于母本株DENV-4 H241,但两者之间没有明显差异,都明显强于乙脑疫苗株SA14-14-2。在PHK细胞传代30次后,小鼠神经毒力虽然有所减低,但并不明显。结论成功构建了嵌合病毒JD4,通过测定并比较JD4与母本株的蚀斑特征、小鼠及乳鼠神经毒力等试验,为分析登革疫苗候选株安全性研究奠定了基础。     

家蚕bHLH转录因子Bmsage可溶性表达、纯化与结构分析

碱性螺旋-环-螺旋(Basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子在生命活动过程中发挥着重要的调控作用。Bmsage是家蚕丝腺中高量表达的一类bHLH转录因子,不仅参与了丝腺细胞在胚胎期的发育调控,而且对蚕丝蛋白的合成也有至关重要的调控作用,然而当前对其性质和结构了解不多。为研究其性质、结构和生物学功能,构建了NusA、MBP、SUMO、Trx和His融合标签的Bmsage重组原核表达载体,通过改变诱导温度和IPTG浓度,确定了Bmsage在大肠杆菌中可溶性表达的最佳载体和表达条件,进而通过镍柱亲和层析纯化获得了Bmsage,利用圆二色光谱研究了其二级结构。结果表明,NusA与MBP标签可显著增强Bmsage在大肠杆菌中的可溶性表达,但难以与Bmsage分离。SUMO标签有一定的助溶效果,并且能够与Bmsage有效分离。其他标签对Bmsage可溶性表达的效果不明显。圆二色光谱分析表明Bmsage含有α-helix结构,推测SUMO标签可能促进了Bmsage折叠形成类天然的结构。这些工作为深入研究Bmsage的性质、结构与功能建立了基础,同时也为其他类似蛋白的表达纯化提供了参考。     

基于文献计量的居民食物消费碳排放研究进展及发展态势

食物是人类生存和发展的基础，然而城市化过程中食物消费产生的碳排放也影响着生态环境与人类福祉。双碳目标下，如何协调食物消费增长与低碳减排之间的矛盾，亟需从不同尺度制定绿色消费优化策略。基于此，从居民食物消费碳排放研究的发文态势、研究方法以及研究内容3个方面进行归纳和梳理。研究发现：①由居民食物消费引起的碳排放问题仍是未来学术界的研究热点之一；②从生产端、消费端及系统视角3个方面对居民食物消费碳排放概念和内涵进行理解，有助于界定碳排放核算边界；③目前居民食物消费碳排放核算的主流测算方法包括生命周期评价（LCA）、碳排放系数、投入产出分析（IOA）和物质流分析（MFA）方法这4种；④从碳排放分布特征看，国内外学者从不同尺度（全球、国家、地区、省域、城市）、不同方式（直接与间接）、不同环节（生产与消费等）、不同消费结构（植物型与动物型）等多角度对其进行探讨；⑤从影响机制来看，基于多尺度时空融合视角量化分析居民食物消费碳排放作用机理这一科学问题值得关注。因此，综合考虑人口、社会、经济等多要素，同时考虑空间异质性，识别居民食物消费碳排放关键机制，构建面向双碳目标的碳减排潜力情景并揭示不同情景下的碳减排贡献，将有助于提出最优的居民生活绿色消费模式。     

乙型脑炎病毒E264位点回复突变对疫苗安全性的影响

目的通过反向遗传学技术,构建乙型脑炎病毒减毒疫苗株SA14-14-2囊膜蛋白(envelope protein,E蛋白)第264位氨基酸的回复突变株,并分析该位点突变对疫苗株小鼠毒力的影响。方法通过融合PCR扩增含基因组第1 769核苷酸位点回复突变的基因片段(T→G),替换SA14-14-2相应区域,使得编码E264位点的氨基酸位点由SA14-14-2的组氨酸(H)回复突变成强毒株SA14的谷氨酰胺(Q),将该回复突变株命名为r JEV264(H→Q),通过测定蚀斑大小和一步生长曲线,分析r JEV264的增殖特征;通过测定该突变株的昆明种小鼠脑内神经毒力、皮下感染入脑能力、腹腔感染入脑能力,分析E264位点回复突变后对小鼠毒力的影响。结果成功构建了回复突变株r JEV264,该突变株蚀斑大小与SA14-14-2相似,在PHK细胞上的增殖特征与SA14-14-2没有明显差异。r JEV264对小鼠有可检测的脑内神经毒力,毒力为5.51 lg PFU/LD50,但无论是皮下注射还是腹腔注射,都没有使小鼠发病。结论在分子水平证明了E264位点是影响乙脑减毒活疫苗安全性的关键位点之一,E264位点的回复突变增强了SA14-14-2的小鼠脑内神经毒力,但没有增强小鼠神经侵袭力。     

家蚕精氨酸激酶原核表达纯化、结构与活性分析

精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)是无脊椎动物体内能量代谢的关键酶,在生长发育、营养利用、免疫抗性、胁迫应答等生命活动过程中发挥着重要的调控作用。家蚕精氨酸激酶BmAK与能量平衡、抗NPV病毒过程相关,但目前关于其分子结构和酶学性质的研究不多。克隆了BmAK基因ORF序列,分析了其染色体定位、基因组结构、mRNA结构、二级结构和三级结构。进化分析表明AK在进化过程中高度保守。原核表达获得了可溶性的BmAK重组蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化了BmAK。圆二色光谱分析显示BmAK包含α螺旋结构,其α螺旋结构在pH 5–10范围内相对稳定。酶活分析表明BmAK的最适温度为30℃,最适pH为7.5。25℃时BmAK的催化活性最大,在15–30℃范围内,BmAK的结构相对稳定,活性差别不大。BmAK的结构在pH 7.0左右相对稳定。这些研究为揭示BmAK的结构和功能提供了基础,有助于开发以AK为分子靶标的绿色安全环保的新型杀虫剂。     

多囊卵巢综合征患者胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌功能与氧化应激的相关性研究

目的:探讨多囊卵巢综合征(PCOS)患者胰岛素抵抗(IR)和胰岛β细胞分泌功能与氧化应激的相关性。方法:选择122名在大连市妇幼保健院生殖保健中心就诊的PCOS患者82例,包括IR组42例和非IR组40例,同期选取单纯因男性因素不育而月经规律、内分泌激素正常的对照组患者40例。检测空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)水平,测定血清活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量以评价机体氧化应激,测定血清总抗氧化能力(TAC)和超氧化物歧化酶(SOD)含量评价机体的抗氧化能力,使用稳态模型评价机体的胰岛素抵抗(HOMA-IR)和胰岛β细胞分泌功能(HOMA-β)。结果:PCOS胰岛素抵抗组患者身体质量指数(BMI)、促黄体素(LH)、黄体生成激素/卵泡生成激素(LH/FSH)、睾酮(T)、FBG、FINS和HOMA-IR显著高于非IR和对照组,而HOMA-β显著低于非IR和对照组,差异均有统计学意义(P0.05);PCOS胰岛素抵抗组血清ROS和MDA含量较非IR组和对照组显著升高(P0.05),非IR组ROS含量显著高于对照组(P0.05),而非IR组和对照组MDA含量相比差异无显著性(P0.05);PCOS胰岛素抵抗组血清TAC和SOD含量较非IR组和对照组显著降低(P0.05),而非IR组血清TAC和SOD含量低于对照组,但差异无显著性(P0.05)。PCOS患者HOMA-IR与体质指数(BMI)及血清ROS和MDA水平呈正相关P0.01),与血清TAC和SOD活性呈显著负相关(P0.05)。结论:氧化应激与PCOS患者胰岛素抵抗密切相关,可能在其胰岛素抵抗发生发展进程中发挥着重要的作用。