乙脑/登革4型嵌合病毒的构建及其小鼠神经毒力测定

目的构建以乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)疫苗株SA14-14-2为基因骨架的乙脑/登革4型嵌合病毒,并分析该嵌合病毒对小鼠的神经毒力。方法通过重叠PCR方法扩增含有登革病毒4型(DENV-4)H241株pr ME基因序列和乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的NS1蛋白前177个核苷酸的融合片段,用Nar I和Bgl II双酶切后替换乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2全长克隆中的相应区域,构建成乙脑/登革4型嵌合全长克隆,通过体外转录和转染BHK21细胞获得嵌合病毒(JEV/DENV-4 chimeric virus,JD4)。通过测定嵌合病毒JD4和2个母本株JEV SA14-14-2株及DENV-4 H241株蚀斑大小、小鼠脑内神经毒力和皮下感染入脑能力、乳鼠脑内神经毒力,比较JD4和母本株之间的差异。通过将JD4在原代地鼠肾(primary hamster kidney,PHK)细胞传代30次,分析传代后嵌合病毒的神经毒力是否减弱及减弱的程度。结果测序结果表明,构建的嵌合病毒JD4基因组序列和预期一致,没有产生新的位点突变。JD4蚀斑较SA14-14-2明显偏小,但和DENV-4 H241株没有明显区别。JD4对3周龄小鼠具有较强的脑内神经毒力,和母本株DENV-4 H241没有差异,对小鼠没有神经侵袭力。乳鼠实验结果表明,嵌合病毒JD4脑内神经毒力虽然略低于母本株DENV-4 H241,但两者之间没有明显差异,都明显强于乙脑疫苗株SA14-14-2。在PHK细胞传代30次后,小鼠神经毒力虽然有所减低,但并不明显。结论成功构建了嵌合病毒JD4,通过测定并比较JD4与母本株的蚀斑特征、小鼠及乳鼠神经毒力等试验,为分析登革疫苗候选株安全性研究奠定了基础。     

固相化HEK细胞在无血清培养基中高效表达重组人活性蛋白C

研究固相化HEK工程细胞的培养和产生rhAPC的水平。先将HEK细胞由贴壁适应为无血清悬浮培养,再用海藻酸钙固定,并在无血清培养基中悬浮培养(最高约为27mg/L)。固相细胞动态培养的表达水平高于细胞静态悬浮培养的表达水平(最高约为50mg/L)。固相细胞动态培养可实现细胞的高密度培养,得到较高的表达水平。     

CA16滴度微量检测方法的建立及其验证

目的建立用Vero细胞检测柯萨奇病毒A组16型(CA16)滴度的方法,并对其适用性进行初步验证。方法通过对细胞种类的选择、细胞接种浓度和细胞病变判定时间的优化,建立测定CA16滴度的半数细胞感染剂量法(CCID50法),并对其进行初步验证。结果通过对病毒感染后细胞病变情况的观察,确定了以Vero细胞作为CA16病毒滴度检定用细胞。Vero细胞的最佳接种浓度和结果判定时间分别为5×104~1×105细胞/mL(即96孔板内每孔加入的最终细胞量为5×103~1×104细胞)和7 d。由4组人员对6批CA16病毒液进行重复检测,实验结果表明不同实验人员测定结果的变异系数(CV)在1.739%~4.974%之间,说明该方法测定结果重复性好,准确度高。结论该法简便、稳定,可以灵敏、准确地检测CA16病毒的滴度,可用于相关疫苗生产过程中的质量控制。     

乙型脑炎病毒E264位点回复突变对疫苗安全性的影响

目的通过反向遗传学技术,构建乙型脑炎病毒减毒疫苗株SA14-14-2囊膜蛋白(envelope protein,E蛋白)第264位氨基酸的回复突变株,并分析该位点突变对疫苗株小鼠毒力的影响。方法通过融合PCR扩增含基因组第1 769核苷酸位点回复突变的基因片段(T→G),替换SA14-14-2相应区域,使得编码E264位点的氨基酸位点由SA14-14-2的组氨酸(H)回复突变成强毒株SA14的谷氨酰胺(Q),将该回复突变株命名为r JEV264(H→Q),通过测定蚀斑大小和一步生长曲线,分析r JEV264的增殖特征;通过测定该突变株的昆明种小鼠脑内神经毒力、皮下感染入脑能力、腹腔感染入脑能力,分析E264位点回复突变后对小鼠毒力的影响。结果成功构建了回复突变株r JEV264,该突变株蚀斑大小与SA14-14-2相似,在PHK细胞上的增殖特征与SA14-14-2没有明显差异。r JEV264对小鼠有可检测的脑内神经毒力,毒力为5.51 lg PFU/LD50,但无论是皮下注射还是腹腔注射,都没有使小鼠发病。结论在分子水平证明了E264位点是影响乙脑减毒活疫苗安全性的关键位点之一,E264位点的回复突变增强了SA14-14-2的小鼠脑内神经毒力,但没有增强小鼠神经侵袭力。     

ELISA法检测乙型脑炎减毒活疫苗中卡那霉素和庆大霉素的残留量

用ELISA试剂盒检测乙脑减毒活疫苗中卡那霉素和庆大霉素的残留量。以间接竞争ELISA法检测线性范围内加入高、中、低3种浓度的卡那霉素和庆大霉素,测定其在疫苗稳定剂、疫苗稳定剂10倍稀释溶液、试剂盒稀释液中的回收率,以及在10倍稀释乙脑减毒活疫苗中的回收率。高、中、低浓度的卡那霉素在疫苗稳定剂、疫苗稳定剂10倍稀释溶液、试剂盒稀释液中的回收率为101.40%～124.80%之间;原倍疫苗稳定剂对庆大霉素的测定有明显干扰,在原倍疫苗稳定剂中低浓度和中浓度的庆大霉素的回收率高达2280%和575%,但其它测定条件下回收率在90%～125%之间。在10倍稀释的乙脑疫苗中加入一定量的卡那霉素和庆大霉素,回收率分别为124%和103.25%。用10倍稀释法测定1人份规格的乙脑减毒活疫苗17批、5人份规格的乙脑减毒活疫苗19批。乙脑减毒活疫苗10倍稀释后,可用ELISA试剂盒检测卡那霉素和庆大霉素残留量。