解淀粉芽胞杆菌hemX基因缺失对血红素合成的影响

血红素是一种广泛存在于生物体中的卟啉类化合物,具有多种生理功能。解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)具有易于培养、分泌表达能力较强等特点,是一种重要的工业菌株。为了筛选血红素合成的最优出发菌株,以不添加和添加5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)的方式,对实验室保藏菌株进行筛选,发现不添加ALA时,菌株BA、BAΔ6、BAΔ6ΔsigF的血红素产量无明显差别;然而添加ALA后,BAΔ6ΔsigF的血红素产量和比生产能力均为最高,分别达到200.77μmol/L和615.70μmol/(L·g DCW)。因此,以BAΔ6ΔsigF为出发菌株,敲除编码细胞色素组装蛋白HemX的hemX基因,探究其在血红素合成途径中的作用,发现敲除菌株发酵液明显变红,且生长未受到明显影响;摇瓶发酵12 h时ALA浓度最高,为82.13 mg/L,略高于对照的75.11 mg/L;不添加ALA时,血红素产量和比生产能力分别为对照的1.99倍和1.45倍;添加ALA后,血红素产量和比生产能力分别为对照的2.08倍和1.72倍;实时定量荧光PCR...     

赭曲霉11α羟化酶的克隆表达及关键氨基酸位点分析

11α,17α-双羟基黄体酮是甾体激素类药物的重要中间体,工业上主要利用霉菌对17α-羟基黄体酮的11α羟化反应制备。对赭曲霉的11α羟化酶及其关键氨基酸位点展开研究,为深入解析酶的催化机理提供基础数据。利用底物转化实验探究了10个羟化反应常用霉菌对17α-羟基黄体酮的转化能力,考察了赭曲霉来源的11α羟化酶CYP68J5在不同表达系统中的活性,借助结构预测、分子对接和定点突变等手段对CYP68J5的关键氨基酸位点进行解析。结果表明,赭曲霉的转化能力最强,转化时间60 h的摩尔产率达到最大值,为78.55%;其羟化酶CYP68J5在酿酒酵母中的表达活性最高;位于底物结合口袋附近的D118、F216、M488是CYP68J5的关键氨基酸位点,这些位点在维持酶的结构稳定性上发挥重要作用,是后续分子改造的潜在重要靶点。     

LaeA在丝状真菌次级代谢、生长发育和其他重要生物过程中的作用

LaeA是在构巢曲霉中首次鉴定的一种全局调控因子,其同源蛋白在丝状真菌中广泛存在,具有高度的保守性。LaeA及其同源蛋白序列存在S-腺苷甲硫氨酸结合基序,是一种甲基转移酶,可能影响组蛋白修饰,导致染色体结构的改变,进而调控一系列基因的表达。大量研究表明,LaeA及其同源蛋白参与调控丝状真菌多种次级代谢产物的生物合成,影响丝状真菌的生长发育和形态分化,甚至在丝状真菌生产有机酸和一些工业酶的过程中也发挥着重要作用。本文综述了LaeA及其同源蛋白的作用机制,以及该蛋白在丝状真菌次级代谢、生长发育和其他重要生物过程中的作用,并对存在的问题及应用前景进行讨论与展望。     

谷氨酸棒杆菌碱基编辑的条件优化

近年来,基于CRISPR/Cas9的碱基编辑技术因其具有不产生DNA双链断裂、无需外源DNA模板、不依赖宿主同源重组修复的优势,已经逐渐发展成为一种强大的基因组编辑工具,在动物、植物、酵母和细菌中得到了开发和应用。研究团队前期已在重要的工业模式菌株谷氨酸棒杆菌中开发了一种多元自动化的碱基编辑技术MACBETH,为进一步优化该方法,提高碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中的应用效率,本研究首先在谷氨酸棒杆菌中构建了基于绿色荧光蛋白(GFP)的检测系统:将GFP基因的起始密码子ATG人工突变为ACG,GFP无法正常表达,当该密码子的C经编辑后恢复为T,即实现GFP蛋白的复活,结合流式细胞仪分析技术,可快速衡量编辑效率。然后,构建针对靶标位点的碱基编辑工具,经测试,该位点可成功被编辑,在初始编辑条件下碱基编辑效率为(13.11±0.21)%。在此基础上,通过对不同培养基类型、诱导初始OD600、诱导时间、诱导物浓度进行优化,确定最优编辑条件是:培养基为CGXII,初始OD600为0.05,诱导时间为20 h,IPTG浓度为0.01 mmol/L。经过优化,编辑效率达到(30.35±0.75)%,较初始条件提高了1.3倍。最后,选取原编辑条件下编辑效率较低的位点,进行了优化后编辑条件下的编辑效率评估,结果显示,不同的位点在最优编辑条件下的编辑效率提高了1.7–2.5倍,进一步证实该优化条件的有效性及通用性。研究结果为碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中更好的应用提供了重要的参考价值。     

植物病害防治相关微生物组研究进展与展望

微生物是人类活动过程中重要的生物资源。植物及其根围土壤中生存着大量多种多样的微生物,这些微生物与植物健康之间存在着密不可分的关系。近年来,基因测序技术的快速发展为植物微生物组结构和功能的研究提供了极大的便利,多种植物相关的微生物组得到了解析。同时更多研究者聚焦于植物病害相关的微生物组研究,通过差异分析,发现了一些特定的有益于植物健康的微生物菌群。此外,植物根围或根内微生物塑造的内在原理也得到了进一步的揭示。一系列植物微生物组研究为植物病害防治和新的微生物资源的挖掘提供了更多思路。     

枯草芽胞杆菌基因组删减对异源酶表达影响的研究进展

枯草芽胞杆菌作为一种遗传背景清晰、基因编辑成熟的革兰氏阳性菌,是多种重要工业酶的生产宿主。随着转录组、蛋白质组、代谢组等多组学测序和分析技术的发展,通过合理设计简化枯草芽胞杆菌基因组,减少细胞内冗余的调控和代谢网络,使得细胞更精简且便于控制,展现出了枯草芽胞杆菌作为异源酶表达宿主细胞的应用潜力。本文简要综述了枯草芽胞杆菌基因组删减的研究进展,归纳了必需基因的确定方法,重点介绍了枯草芽胞杆菌通过删减基因组提升异源酶表达的研究进展及删减策略,充分展示了枯草芽胞杆菌基因组删减在构建异源酶表达底盘细胞中的重要作用。     

枯草芽孢杆菌在系统与合成生物技术中研究进展及工业应用

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是微生物生理生化机理研究的模式菌株,也是工业应用生产小分子化合物、大宗化学品、工业酶、药物及保健品等生物制剂的良好底盘细胞。近些年,研究枯草芽孢杆菌的合成生物技术和代谢工程方法日新月异,为利用其作为底盘细胞生产目标产品提供了良好的工具和理论参考。文中综述了利用枯草芽孢杆菌为细胞工厂,在代谢改造中通过调节全局调控因子,基因组精简及优化,多位点、多维调控,自身生物传感动态调控,膜蛋白工程等方法,系统调控优化菌株;在蛋白质试剂生产改造中,通过优化基因启动子、蛋白质信号肽、菌株自身蛋白质分泌元件,构建无化学诱导剂表达系统等方法,优化生产菌株。另外,文中对未来进一步针对优化枯草芽孢杆菌进行工业生产中需要注意和重点关注的问题、方向进行展望。     

异源表达多巴脱羧酶促进大肠杆菌从头合成多巴胺

多巴胺是多种天然抗氧化药物生物合成的前体物质,在人体内作为神经递质调控中枢神经系统的多种生理功能,常用于多种类型休克的临床治疗。目前,通过微生物合成技术已经实现了多巴胺的从头合成,但是合成效率很低。针对该问题,在左旋多巴 (l-DOPA) 大肠杆菌工程菌基础上,利用不同拷贝数质粒表达野猪Sus scrofa来源的多巴脱羧酶基因Ssddc,实现了葡萄糖到多巴胺的生产。为了进一步提高多巴胺合成效率,从100个候选基因中筛选出5个多巴脱羧酶基因进行测试,其中来源于人Homo sapiens多巴脱羧酶基因Hsddc的工程菌摇瓶发酵的多巴胺产量最高,达到3.33 g/L;而来源于果蝇Drosophila melanogaster多巴脱羧酶基因Dmddc的工程菌摇瓶发酵的左旋多巴残余量最低,仅有0.02 g/L;这两株工程菌分批补料发酵表明,多巴胺的产量可以分别达到13.3 g/L和16.2 g/L,左旋多巴残余量分别是0.45 g/L和0.23 g/L。将多巴脱羧酶基因Dmddc和Ssddc分别整合到基因组上,获得遗传稳定的工程菌,在分批补料发酵条件下,多巴胺产量最高达到17.7 g/L,是目前国内外报道的最高产量。     

丝状真菌代谢工程研究进展

丝状真菌(Filamentous fungi)作为重要的工业发酵微生物,在有机酸、蛋白质及次级代谢产物等关键生物基产品生产方面发挥着重要作用。自20世纪90年代代谢工程理念提出以来,尤其是代谢工程使能技术的创新及发展,极大地促进了丝状真菌细胞工厂的构建及其在工业发酵领域的应用。文中将系统介绍近年来丝状真菌代谢工程技术的发展,及其在生物基化学品细胞工厂构建中的应用,最后讨论丝状真菌代谢工程中关键问题并展望其未来发展。     

芽胞形成相关基因缺失对解淀粉芽胞杆菌生物量及胞外酶表达的影响

解淀粉芽胞杆菌作为公认的安全生产宿主菌(GRAS),在高效表达异源蛋白方面具有巨大的发展潜力和应用前景。本研究以解淀粉芽胞杆菌TCCC111018为出发菌株,通过敲除芽胞形成相关基因(spo0A,sigF和sigE),构建了一系列突变菌株(BAΔspo0A,BAΔsigF,BAΔsigE),并对突变株生物量和胞外酶表达量进行分析比较。结果表明,与出发菌株BAΔupp相比,菌株BAΔspo0A的生物量及胞外酶表达量显著降低,BAΔsigE无明显变化,而菌株BAΔsigF的生产性能有显著提升,菌体生长的稳定期延长约6 h,产酶时间提前,耐酸性α-淀粉酶与碱性蛋白酶酶活分别提高了25.2%和21.3%,该菌株的成功构建为工业酶生产宿主提供了新的选择,也为异源酶的高效生产提出了一种新的策略。