酿酒酵母遗传缺陷型菌株化学转化方法研究

目的:通过改善转化条件,提高缺陷型酿酒酵母DNA转化效率。方法:以醋酸锂化学转化法为基础,以酿酒酵母菌株fab1::KAN作为遗传转化受体,以敲除MZM1基因为转化目的,对影响遗传缺陷型菌株转化效率的参数(醋酸锂前处理、热激时间及转化后复苏时间)进行优化,确定适合缺陷型酵母DNA转化的最佳方法。结果:不同时间(30 min,60 min和120 min)醋酸锂的前处理均可以提高其转化效率,热激前使用醋酸锂处理酵母30 min转化效率最高;热激10 min是转化效率由高到低的转折点,30 min热激明显降低了转化效率;YPD培养基用于转化后酵母的复苏,随培养时间(30 min,60 min和120 min)的延长,酵母转化效率逐步增加,120 min作为热敏性菌株转化后的复苏时间较佳。结论:与野生型菌株类似,通过转化条件的优化,遗传缺陷型菌株的转化效率也可以满足大多数试验要求。     

西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的克隆及原核表达西藏小型猪瘦素（Leptin）成熟肽及瘦素受体胞外区片段。方法根据西藏小型猪瘦素序列（GenBank号：GQ240885.1）和猪瘦素受体基因胞外域序列（GenBank号：AF167719.1）分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片段。再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanHⅠ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位（成熟肽编码区）和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存。此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×103左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×103左右的融合蛋白。结论说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21（DE3）中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础。     

胡桃醌不同给药途径对人肝癌细胞BEL-7402裸鼠皮下移植瘤生长的影响

目的采用裸鼠皮下移植瘤模型,通过不同给药途径对胡桃醌抗肿瘤活性和毒性进行评价。方法建立人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过腹腔注射和局部注射两个给药途径观察胡桃醌抑制肿瘤生长的效果。结果①以600、300和150μg/kg胡桃醌腹腔注射于人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,发现该剂量胡桃醌对肿瘤生长没有明显的影响;NK细胞活性检测发现,600、300μg/kg胡桃醌对裸鼠免疫功能有影响(P均<0.01),150μg/kg胡桃醌则没有影响(P>0.05);与阳性对照组(5-Fu)相比,600μg/kg胡桃醌组NK细胞活性差异无显著性(P>0.05),300和150μg/kg胡桃醌组NK细胞活性差异有显著性(P<0.05,P<0.01),结果提示胡桃醌对小鼠免疫系统有一定的损伤作用。②以4.5、3和1.5 mg/kg胡桃醌腹腔注射于人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,抑瘤率分别为为78.24%、66.57%、48.94%;4.5、3 mg/kg胡桃醌的抑瘤作用可与阳性对照组比拟(P均>0.05)。但4.5 mg/kg胡桃醌组裸鼠出现明显的皮下脂肪减少、消瘦,并有死亡现象。③以pH 7.4和pH 4.0的600、300和150μg/kg胡桃醌人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型局部给药,结果发现不同pH(pH 7.4或4.0)600、300μg/kg的胡桃醌局部注射抑瘤作用与阳性对照组(5-Fu)组差异无显著性(P>0.05),而不同pH的150μg/kg胡桃醌抑瘤作用不明显。同一浓度不同pH药物的抑瘤作用差异无显著性(P均>0.05),但pH 4.0的胡桃醌组肿瘤细胞肝转移较少。结论胡桃醌不同给药途径均可抑制人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤的生长,但有一定的毒副作用,药物安全范围较小。     

西藏小型猪与高原藏猪的血液生理生化值的比较

目的比较西藏小型猪与高原藏猪的血液生理、生化指标的差异。方法采用全自动血液细胞和生化分析仪测定21个血液生理生化指标。结果藏猪与西藏小型猪之间,红细胞、白细胞、血小板计数、总胆固醇、血清甘油三酯指标的测定差异有显著性,谷草转氨酶、血清总蛋白、血清清蛋白、葡萄糖、肌酸激酶指标的测定差异极显著。其中红细胞、白细胞、谷草转氨酶、肌酸激酶的值藏猪高于西藏小型猪,而血小板计数、血清总蛋白、血清清蛋白、葡萄糖、总胆固醇、血清甘油三酯的值藏猪低于西藏小型猪。结论不同的生活环境、气候条件和营养水平会对动物的血液生理、生化值的测定造成一定的影响。     

慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠

目的利用慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白（mRFP）转基因小鼠,并建立转基因小鼠的技术平台。方法将携带mRFP基因的慢病毒注入ICR鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔代鼠,然后应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等鉴定并获得mRFP转基因鼠。结果移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎40枚给2只假孕母鼠,共获得仔鼠6只;利用体视荧光显微镜检测mRFP表达,在蛋白水平证实6只F0代中,2只（R3和R4）鼠耳高表达mRFP,其余的弱表达mRFP（R1、R2和R5）或荧光强度（R6）与野生型ICR鼠无明显差别,而DNA水平检测证实,6只F0代中,5只（R1、R2、R3、R4和R5）基因组中整合有外源转基因hUb-mRFP,预示基因型鉴定结果很好验证了体视荧光显微镜鉴定结果。此外,mRFP转基因首建鼠基因组中整合的mRFP基因可稳定遗传和表达。结论建立了慢病毒法快速制备转基因小鼠的技术平台,这为针对不同基因建立相应转基因小鼠以实现恒定或条件性的转基因过表达或RNA干涉（RNAi）,并进而在体内解析相应基因功能和建立人类疾病模型等奠定了坚实基础。     

两个国内小型猪品种GH基因部分序列的多态性分析

目的对西藏小型猪和广西巴马小型猪生长激素基因（GH基因）部分序列的多态性进行分析。方法采用内切酶ApaI和Hin6I对西藏小型猪（108头）和广西巴马小型猪（132头）GH基因-119 bp～＋486 bp之间的区域进行PCR-RFLPs分析。结果 （1）从ApaI酶切产生的结果来看,ApaI酶切产生A（449 bp＋101 bp＋55bp）,B（316 bp＋133 bp＋101 bp＋55 bp）两种等位基因。等位基因A的频率高于等位基因B,等位基因A为优势基因。AA基因型频率高于AB和BB基因型频率;（2）从Hin6I酶切产生的结果来看,Hin6I酶切产生G1（605bp）、G2（498 bp＋107 bp）、G3（449 bp＋156 bp）、G4（449 bp＋107 bp＋49 bp）四种等位基因。等位基因G4的频率高于等位基因G1、G2、G3。等位基因G1频率很低。基因型G2G3、G2G4、G3G4、G4G4的频率较高。（3）由酶切产生的基因和基因型多态性,发现西藏小型猪与广西巴马小型猪在该基因部分序列差异不显著（P〉0.05）。结论国内的优质实验用小型猪,如西藏小型猪和广西巴马小型猪等位基因A频率均较高。     

慢病毒载体法制备遗传工程猴和小型猪的现状及应用前景展望

较小鼠等啮齿类动物而言,猴和小型猪等大型实验动物在亲缘关系上与人类更为接近,在解剖、生理生化代谢及疾病发病机制等多方面与人类更接近,使它们在复制人类疾病模型,研究疾病发病机制和新药研发等中有无可替代的应用。而制备遗传工程大动物可以更深入地解析人类疾病,并可为器官移植和新药研发提供更充分的实验材料。基于慢病毒介导的转基因方法近几年已越来越多地被用来制备遗传工程猴和小型猪。与传统的原核显微注射方法和体细胞核移植法相比,慢病毒介导的转基因方法转基因效率高,操作更简单。因此,构筑基于慢病毒介导的转基因方法制备遗传工程猴和小型猪的技术平台将对生物医学研究产生巨大推动作用。     

西藏小型猪心脏、呼吸系统组织学观察

目的积累西藏小型猪心脏和呼吸系统的组织学资料,对西藏小型猪在相关生物学研究上的应用提供参考。方法将西藏小型猪心脏和呼吸系统各脏器固定于10％中性甲醛溶液中,常规石蜡切片,HE染色,光镜下观察。结果西藏小型猪心脏壁厚,心内膜下浦肯野纤维粗,束细胞大而清晰,排列规则;心肌纤维粗大,排列紧密,横纹较模糊,润盘少且不清楚,肌间血管丰富;心外膜较厚。西藏小型猪鼻黏膜较厚;气管和支气管假复层柱状纤毛上皮排列紧密,纤毛粗而长,黏膜下腺体量少;肺支气管周围无炎性细胞浸润,肺泡腔内尘细胞极少,肺泡壁和肺间质血管较丰富。结论西藏小型猪心脏、呼吸系统表现出高原动物组织学特点,其这种特点对今后西藏小型猪实验所涉及的组织学判断有重要参考价值。     

西藏小型猪肾脏应用组织学特点

目的研究西藏小型猪肾脏的组织结构,为其在生物医药领域中的应用提供形态学依据。方法取西藏小型猪肾脏标本投入10%中性福尔马林溶液固定24 h以上,修块,冲洗,脱水,透明,包埋,常规石蜡切片,HE染色,光镜观察拍照。结果西藏小型猪的肾与人肾一样呈长而扁的菜豆形,是表面光滑的多乳头肾,肾的表面有致密的结缔组织构成的被膜,肾实质可分为皮质和髓质,由数百万个肾单位和泌尿小管组成,其间由少量结缔组织、血管和神经等构成肾间质。结论西藏小型猪的肾脏结构比犬和猴更接近于人类,在异种器官移植、药物临床前安全性评价等生物医药领域中具有重要应用前景。     

利用人脐带血干细胞制备人鼠肝组织嵌合体模型

目的利用人脐带血干细胞研究制备HBV感染人鼠嵌合小鼠模型。方法将人脐血干细胞,经尾静脉分两次注射到裸鼠体内。分别于第7,14,21天取肝组织,进行AFP免疫组织化学检测,分析人肝细胞在裸鼠体内嵌合生长情况,并进行乙肝病毒感染实验,定量检测感染后小鼠血清中AFP、ALB。结果实验组小鼠在第7、14、21天肝脏内AFP持续阳性表达,AFP表达于细胞质内。HBV感染后小鼠肝脏HBsAg组化显示密集成片的阳性细胞。实验组和对照组表达差异显著（P〈0.05）。结论将人脐血干细胞移植裸鼠肝脏内可以存活并分化成人肝细胞形成嵌合鼠,并能被HBV感染。