两种价态铬(Ⅲ,Ⅵ)对真核酵母细胞谷胱甘肽水平影响

工业的迅猛发展使得重金属污染加剧,得到了人们的广泛关注。铬(Cr)在化工业中的广泛应用,使其成为一种主要的环境污染重金属离子。酿酒酵母是研究金属毒性最常用的生物之一。本文比较了三种铬盐(三氯化铬、三氧化铬、重铬酸钾)对酿酒酵母生长的影响,半抑制浓度的两种价态铬(Cr^3+,Cr^6+)处理酵母细胞,Cr^6+引起细胞的致死率更高。已有研究表明谷胱甘肽是胞内重要的还原剂,常用于细胞的重金属解毒,因此探究了两种价态的铬对酵母胞内谷胱甘肽水平的影响。结果显示重铬酸钾和三氧化铬浓度的升高都会引起胞内含量显著降低,而三氯化铬基本不变,过表达GSH1基因有利于提高酵母细胞对Cr^6+的抗性,但对Cr^3+没有明显效果,这说明两种价态铬在胞内生化作用方式不同,细胞应对的解毒机制也不一样。该研究对工业含铬废弃物处理和微生物治理环境污染提供了理论依据。     

一株降解煤油菌株的筛选与鉴定

本文通过从污水处理厂活性污泥中分离得到一株高效降解轻油(煤油)细菌5092-2,通过形态学、16S rRNA鉴定该菌为Mangroveibacter sp.。进一步对其生长条件进行了研究,发现该菌在23℃到38℃、pH为5.0到9.0范围内生长无明显差异。在温度为35℃,pH 7.2~7.4,160 r/min培养7 d,菌株降解煤油的能力达到52.3%,具有进一步研究的价值。     

大腹园蛛管状腺丝重组蛋白的克隆表达及纺丝

TuSp1蛋白(tubuliform spidroin 1)是管状腺丝(tubuliform silkfiber)的主要组成成分。管状腺丝作为蛛丝卵袋的外层包卵丝,其结构具有很好的耐腐蚀性和良好的力学性能。目前国内外对大腹园蛛TuSp1蛋白的研究很少,仅有一条基因序列的报道。本课题首次构建含大腹园蛛N端非重复结构域、重复单元以及C端非重复结构域的重组管状腺丝蛋白TuSp1 NT-Rp-CT,并经湿法纺丝获得重组蛋白丝纤维。重组蛋白液圆二色谱分析结果显示,pH由7.0降低到5.5的过程中,始终保持稳定的α-螺旋构象;重组蛋白丝纤维的傅里叶变换红外光谱结果显示,丝纤维中主要二级结构为β-折叠及β-转角;经扫描电镜观察发现,冻干的絮状重组蛋白能自组装成丝纤维,且表面光滑纤细;湿纺后的重组蛋白丝纤维直径较粗,但表面较平整均匀,具有类似天然管状腺丝的形态特征,这些为TuSp1蛋白的成丝机理及仿生纺丝研究提供了理论依据。     

表达透明颤菌血红蛋白基因对酿酒酵母生长及细胞内氧化状态的影响*

透明颤菌血红蛋白基因vgb在多种研究和工业发酵菌中异源表达很好的解决了高密度发酵中的溶氧率问题。酿酒酵母是经典的真核模型,且在发酵工业中具有重要的应用价值,但vgb在酿酒酵母中异源表达对细胞生长的影响并不清楚。以ADH1为启动子构建了含透明颤菌(Vistreoscilla)血红蛋白基因vgb的异源表达质粒YEplac195-ADH1pr-vgb,并转化至酿酒酵母BY4741。通过生长敏感性实验,发现在发酵碳源和非发酵碳源中,vgb的异源表达均抑制了菌株生长。接着,通过2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐和PI染色和脂质过氧化产物检测分析,发现过表达vgb的酿酒酵母细胞中活性氧(ROS)的积累、细胞膜通透性改变以及脂质过氧化。结果表明,酿酒酵母中过表达vgb改变细胞的氧化状态促进活性氧的累积,氧化应激导致菌株的生长抑制。     

人脂素基因LIPIN1在酵母中的异源表达及细胞功能分析

脂类代谢调控是维持生物体能量平衡的重要环节,脂类代谢调控的紊乱与肥胖症、糖尿病和高血压等疾病密切相关。脂素基因三LIPIN1是诱导脂肪细胞分化、调控脂类合成的关键基因．其编码的磷脂磷酸酶（phosphatidate phosphatase,PAP）在人体三酰甘油合成中起关键作用,是维持人体脂类平衡的重要保障。此外,该基因还作为重要的转录辅激活因子参与多种生长及营养代谢调控。多种生物中均有类似功能的基因被发现,暗示了其功能的多样性及物种间的保守性。该文利用酿酒酵母在脂类代谢研究中性状易于表征、同源基因剧刖功能明确的优势,通过同源重组技术构建脂素缺陷型酵母,探索脂素基因在维持酵母正常生长及脂类合成中的重要作用,并通过功能互补及生物信息学技术对比分析了人源LIPIN1基因与酵母PdH1基因编码蛋白在结构和功能上的保守性,为脂素基因LIPIN1的细胞功能研究提供基础数据。     

利用慢病毒介导的shRNA在GT1-7细胞中敲低Srsf1及其对GnRH、Kiss1的影响

目的:探讨慢病毒介导短发夹RNA(shRNA)敲低丝氨酸/精氨酸富集剪接因子1(Srsf1)基因对小鼠GT1-7细胞中性发育相关基因促性腺激素释放激素(GnRH)、Kiss1的影响。方法:实验分为3组,即空白对照组、阴性对照组及shRNA干扰组。用Srsf1 shRNA慢病毒稳转GT1-7细胞,Real-time PCR和Western blot检测GT1-7细胞中Srsf1在mRNA和蛋白水平的变化,并检测稳转株中GnRH、Kiss1基因的表达情况。结果:慢病毒介导的shRNA成功感染了GT1-7细胞,与空白对照组及阴性对照组相比,shRNA干扰组中Srsf1在mRNA水平降低了45%(P0.001),在蛋白水平敲低了42%(P0.05)。在稳定低表达Srsf1的GT1-7细胞中,GnRH、Kiss1基因在mRNA水平也显著降低(P0.05)。结论:成功的构建了Srsf1基因敲低的细胞株。在GT1-7细胞中敲低Srsf1基因会抑制GnRH、Kiss1基因的表达。     

脂肪酸延长酶缺陷对酵母细胞脂质代谢及油酸胁迫响应的影响

生物医学证据表明,过量的油脂特别是脂肪酸(fatty acids,FA)在非脂肪组织累积会引起脂代谢障碍,引起细胞功能紊乱或坏死。脂肪酸延长酶家族参与脂肪酸代谢,具有真核生物的高度保守性,且与膜脂的代谢密切相关。但脂肪酸延长酶与细胞脂毒效应的关系并不清楚。该文利用模式生物酿酒酵母在脂类代谢研究中性状易于表征、遗传操作便利的优势,通过对比脂肪酸延长酶缺陷型elo1Δ、elo2Δ和elo3Δ与野生型酵母(wild-type,WT)对不同脂肪酸胁迫的响应,发现极长链脂肪酸延长酶基因ELO2和ELO3缺陷后对油酸(oleic acid,OLA)高度敏感;细胞脂滴及中性脂质的代谢对维持细胞脂类平衡起关键作用。研究结果显示,长链脂肪酸的合成缺陷或油酸处理均促进细胞脂滴的形成,同时显著提高细胞中性油脂(TAG)和甾醇酯(SE)合成;采用气相色谱–质谱联用技术分析脂肪酸组成,结果显示,ELO3缺陷,C_(26)脂肪酸基本检测不到,而C_(20)与C_(22)脂肪酸会累积;ELO2缺失后,C_(26)脂肪酸的含量也明显降低。而油酸的处理会增加BY4741胞内总的极长链脂肪酸的比例;elo2Δ和elo3Δ的不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例增大;相反,过表达脂肪酸延长酶基因,与野生型菌株相比能显著降低细胞油酸的含量。模式生物脂肪酸延长酶对细胞脂质代谢及油酸胁迫响应的研究,为医学脂代谢障碍及细胞脂毒效应研究提供了基础数据。     

利用荧光PCR技术对Crispr/Cas9敲除microRNA 505的小鼠进行鉴定

利用荧光PCR技术对Crispr/Cas9系统敲除的micro RNA 505小鼠进行鉴定,能快速检测出敲除小鼠的基因型,有效加快敲除小鼠基因功能验证的进程。首先,在Crispr/Cas9系统敲除的基因位点区域设计PCR引物,并在上游引物的5′端使用羟基荧光素(5-carboxyfluorescein,FAM)荧光修饰。模板经过PCR的扩增后,将PCR产物与已知片段大小的6-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯(6-carboxy-X-rhodamine,ROX)混合,在377测序仪上通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。随后,根据相对分子质量内标法计算出PCR产物大小,从而达到鉴定小鼠基因型的目的。将上述荧光PCR技术应用于实践发现,两只奠基鼠、16只F1代小鼠以及26只F2代小鼠都能得到准确的鉴定,其中包括microRNA 505基因区段被敲除了17 bp和23 bp。因此,利用荧光PCR技术可以快速、准确地鉴定Crispr/Cas9敲除小鼠。     

SAM-V核糖开关RNA体外转录体系优化

为了提高RNA体外转录效率,选取SAM-V核糖开关晶体结构模板对RNA体外转录体系进行优化。结果表明:目的RNA相对百分含量在反应时间和Mg2+添加浓度分别为8h和85m M/L时达到最高值,优化体系较标准体系目的RNA相对百分含量提高了一倍。我们的工作为下一步准备SAMV核糖开关晶体打下了基础。     

多重定量PCR检测PDX模型小鼠细胞浸润比例的构建

摘要 目的：建立一种快速、灵敏的方法检测人源异种移植模型(Patient-Derived tumor Xenograft,PDX)中小鼠细胞的浸润比例,以确保PDX模型的保真性。方法：选择人和小鼠的特异性基因PSMB2、Ren 2的部分区段设计引物和探针,利用多重荧光定量PCR（TaqMan探针法）在单管中检测PDX模型中小鼠-人细胞的相对量。另外,构建了不同浸润比例的标准品作为阳性对照,根据标准曲线进行样本比例计算。结果：建立了一种多重荧光定量PCR检测PDX模型小鼠细胞浸润比例的检测方案,该方案显示,PDX模型中不同比例的人鼠混合样本与△Ct值（Ct（小鼠）-Ct（人））之间线性关系良好,相关系数r²为0.9998。利用该方法对14个样本进行检测,结果表明在绝大部分样本中小鼠细胞的比例低于30.00%,平均小鼠细胞比例为13.38%。结论：本研究建立的多重定量PCR检测PDX模型中小鼠细胞浸润比例的方法能够根据△Ct值快速、准确推断PDX模型中人、小鼠细胞的比例。该方法操作简单、耗时短、结果可靠,是一种快速、灵敏的PDX模型的质控方案。