双管基因枪介导的基因瞬时表达技术在拟南芥中的应用

基因瞬时表达是植物中研究目标基因功能的常用手段。在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中, 相比原生质体和农杆菌介导的基因异源表达技术, 利用粒子轰击进行基因瞬时表达一直鲜有报道。其主要原因是拟南芥叶型相对较小、基因枪操作相对烦琐以及基因表达效率差异较大。该研究通过优化双管基因枪系统, 在营养生长旺盛的拟南芥莲座叶中实现GFP和GUS基因高效表达。同时, 通过GUS报告基因明确了坏死诱导因子BAX、Avh238和ATR13/Rpp13激发拟南芥细胞坏死的表型。但在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中明显诱导细胞坏死的Avrblb1/RB基因对, 在拟南芥中却丧失了诱导细胞坏死的活性。由于双管基因枪系统每次轰击时设置平行对照, 可有效降低转化实验中的样本变异度, 为拟南芥及其突变体研究中准确评价基因功能和高通量筛选目标基因提供新的技术参考。     

天葵子化学成分及抑菌活性研究

为探究天葵子化学成分及其抑菌活性。采用色谱法从天葵子中分离得到13个化合物,利用波谱学等方法鉴定了它们的化学结构,分别鉴定为蝙蝠葛内酯(1)、格列风内酯(2)、β-谷甾醇(3)、胡萝卜苷(4)、对羟基苯乙醇(5)、邻苯二甲酸-二-2-乙基-己酯(6)、小檗碱(7)、木兰碱(8)、唐松草酚定(9)、果糖(10)、紫草氰苷(11)、小檗红碱(12)、bauhinin(13)。其中化合物12和13为首次从天葵子中分离得到。采用滤纸片琼脂扩散法测定了所得化合物的抑菌活性,其中化合物7和12具有明显的抑菌活性,在载药量为5μg/片时,化合物7对白菜软腐病菌和猕猴桃溃疡病菌的抑菌圈直径分别为19.4、13.3mm;化合物12对青枯病菌和猕猴桃溃疡病菌的抑菌圈直径分别为13.2、12.8mm,表明天葵子对于防治作物细菌性病害具有较好的应用前景。     

柑橘凤蝶蛹发声器的显微结构及防御作用(英文)

【目的】动物界存在多种用于对抗捕食者的防御机制。一些鳞翅目昆虫的蛹在受到机械刺激时会发出蠕动的声音。【方法】在扫描电镜下对柑橘凤蝶Papilio xuthus蛹的发声器形态特征进行观察,并使用Audacity软件对捕获的声音进行特征分析。【结果】柑橘凤蝶蛹在腹部第4-5节和第5-6节之间的节间膜上存在发声器,有规律地发出嘶嘶声。发声器由多层甲壳素构成的刮器和板组成,刮器和板上有 50~90个突起。当蛹的腹部被寄生蜂触角刺激30 s以上时,刮器和板会迅速相互摩擦,腹部反复摆动发出声音。蛹发出的声音是由一系列每2 000~3 000 ms发生3次的短脉冲组成的。频带很宽,主要分布在5~20kHz范围内。新鲜蛹和越冬蛹的活性不同,声强也不同。【结论】本研究首先描述了柑橘蝴蝶蛹发声器的结构,结果支持了一些蝴蝶蛹对寄生生物进化出一种特殊的防御机制(声学防御)的假说。此外,通过比较两种生境的柑橘凤蝶蛹的声波特征,我们提出了同一物种在不同地理区域可以产生方言的假说。 关键词:     

缺失宿主Vta1蛋白的MIT结构域对杆状病毒AcMNPV复制的影响

【目的】克隆草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Vta1基因,检测Vta1在苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)复制中的作用。【方法】利用反转录-PCR与PCR方法筛选草地贪夜蛾Vta1基因及缺失Vta1N-端MIT结构域的突变体并构建其瞬时表达质粒,通过转染Sf9细胞检测表达;构建Vta1及其突变体的双分子荧光互补表达质粒,并通过瞬时转染检测其与Vps4及ESCRT-III亚基Vps46与Vps60的相互作用;共转染gp64与Vta1及其突变体瞬时表达质粒,检测瞬时表达Vta1突变体对AcMNPV出芽型病毒产量及病毒基因启动子指导报告基因表达的影响。【结果】获得了草地贪夜蛾Vta1基因。氨基酸序列相似性分析表明,昆虫、酵母与人类Vta1同源蛋白的相似性分别约为20%与50%。Western blotting分析表明GFP标签的Vta1及其突变体均能在瞬时转染的Sf9细胞中表达。双分子荧光互补分析发现,缺失第1个或第2个MIT结构域显著降低Vta1突变体与Vps4、Vps46或Vps60的相互作用。此外,瞬时表达Vta1突变体显著降低了AcMNPV感染性出芽型病毒的产量,但并未影响AcMNPVie1基因早期启动子和p6.9基因晚期启动子指导的LacZ和GUS报告基因的表达。【结论】Vta1可能参与杆状病毒AcMNPV子代病毒粒子的组装和/或出芽释放过程。     

陕西苹果园山楂叶螨抗药性监测

【目的】明确陕西省苹果园的山楂叶螨Tetranychus viennensis Zacher种群对5种药剂的抗性水平。【方法】采用玻片浸渍法,建立了山楂叶螨室内饲养的相对敏感种群对5种杀虫剂的敏感基线,同时从陕西乾县、礼泉、兴平、澄城、安塞、淳化、凤翔和扶风8个不同地区的苹果园采集山楂叶螨,分析这些田间种群的抗药性水平。【结果】山楂叶螨室内相对敏感种群对阿维菌素的敏感性最高,对毒死蜱敏感性最低;各种群对哒螨灵已产生了13.29~69.63倍的抗性;对高效氯氟氰菊酯已经产生了7.99~46.74倍的抗性;除兴平种群对阿维菌素表现为低抗水平外(抗性倍数7.63),其余种群对阿维菌素表现为敏感或者敏感性下降(抗性倍数1.89~3.94);除扶风种群对毒死蜱抗性水平处于敏感性下降的阶段外,其它7个种群对毒死蜱的均处于敏感阶段;各种群对噻虫嗪均处于敏感阶段。【结论】山楂叶螨室内相对敏感种群对5种不同杀虫剂的敏感性不同;各田间种群对哒螨灵和高效氯氟氰菊酯两种药剂已经产生了不同水平的抗药性,除兴平种群对阿维菌素产生低抗水平抗性外,其余田间种群对阿维菌素、毒死蜱和噻虫嗪抗性均表现为敏感或者敏感性下降;田间防治时应该减少哒螨灵和高效氯氟氰菊酯两种药剂的使用,同时注意不同农药的轮换使用,以此延缓山楂叶螨对杀虫剂产生高水平抗药性。     

棉铃虫中肠氨肽酶APN4与Cry1Ac、Cry2Aa结合能力的比较

【目的】Bt杀虫蛋白(Bacillus thuringiensis)具有高度的靶标特异性,已经被广泛用于农业害虫防治。Bt杀虫蛋白要发挥杀虫活性,必须首先与其受体蛋白结合,氨肽酶N(Aminopeptidase N)是一类重要的Bt受体蛋白。因此,分析该受体与Bt杀虫蛋白的结合能力,可为进一步明确不同Bt的分子作用机制、Bt的抗性治理以及新Bt的开发应用等提供借鉴。【方法】本文利用Ligand blot和Elisa方法比较了棉铃虫Helicoverpa armigera中肠APN4(Aminopeptidase N4,APN4)与Cry1Ac、Cry2Aa的结合能力。【结果】原核表达的APN4片段与活化的Cry1Ac、Cry2Aa都可以结合,解离常数(Kd)分别是48.59 nmol/L和21.73 nmol/L。【结论】APN4片段与Cry1Ac、Cry2Aa的结合能力在数量级上不存在显著性差异。     

生物源农药在苹果蠹蛾防治中的应用

苹果蠹蛾是世界性检疫害虫,对我国苹果优势产区构成了巨大威胁。长期依赖化学防治使该虫抗性问题变得十分严峻。为了保障食品安全,以环境友好的生物源农药替代化学农药已成为当前苹果蠹蛾防治的热点。本文对国内外现有的生物源农药,如寄生蜂、不育昆虫、颗粒体病毒、病原线虫、Bt、病原真菌、微孢子虫、性信息素、斑蝥素、多杀菌素等,在苹果蠹蛾防治中的最新应用及其存在的问题进行论述,讨论了生物源农药凭借其种类多、来源广且在用药时期上选择性强等特点,在该虫综合治理中的重要地位及面临的挑战。     

苹果蠹蛾抗药性研究进展

苹果蠹蛾是世界各国高度关注的严重危害苹果生产的外来有害生物。该虫于20世纪50年代在我国首次报道,目前是我国一类进境检疫性有害生物,正严重威胁我国苹果主产区的水果生产安全。苹果蠹蛾以幼虫钻蛀到果实内部为害,防治难度高,对其主要采用化学农药、交配干扰和苹果蠹蛾颗粒体病毒进行防治。由于农药的长期大量使用,苹果蠹蛾已对有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、昆虫生长调节剂、阿维菌素和苹果蠹蛾颗粒体病毒等不同类型的杀虫剂产生了抗药性。本文总结了国内外有关苹果蠹蛾抗药性现状和抗药性机理方面的研究,并分析了其对几种农药产生抗性的主要原因,同时结合国外苹果蠹蛾防治和抗药性相关研究,以及其在我国发生与防治的现状,提出该虫抗药性治理策略,即及时对我国疫区苹果蠹蛾的抗药性现状进行监测,在此基础上,注意科学地使用化学农药,并结合农业防治和生物防治等措施对该虫进行综合治理。     

土壤中棉花黄萎病菌SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR定量检测技术研究

为实现田间土壤棉花黄萎病菌的早期检测,建立了土壤中棉花黄萎病菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。以含342bp PCR扩增产物的阳性质粒为参考,构建了标准曲线,并对该曲线的特异性、敏感性、可重复性进行了评价。结果表明,该方法具有快速、特异性强、敏感度高等特点。检测范围在3.8×103-3.8×108copies/μL之间有良好的线性关系,相关系数R2为0.996,扩增效率为101.5%,灵敏度比常规PCR方法高102倍。     

条形柄锈菌吸器特异效应蛋白Hasp68抑制寄主免疫并与小麦组织蛋白酶B互作

作为活体营养专性寄生真菌,条形柄锈菌（小麦条锈病）在侵染过程中通过形成吸器向寄主细胞释放效应蛋白,干扰寄主的防卫反应,促进其侵染与致病。因此,条形柄锈菌效应蛋白的鉴定与功能研究对揭示其毒性机理具有重要意义。本实验室前期完成了条形柄锈菌CYR31生理小种吸器转录组分析,从中鉴定得到一个吸器特异诱导表达分泌蛋白Hasp68,利用农杆菌侵染在烟草细胞中瞬时表达该基因,能够抑制小鼠促细胞凋亡蛋白Bax诱导的细胞程序性死亡,鉴定为条形柄锈菌候选效应蛋白。Hasp68基因全长318bp,编码105_aa,N-端包含20_aa的信号肽,无保守结构域。BlastX分析表明Hasp68为条形柄锈菌特有效应蛋白,在其他真菌中无同源蛋白,且在条形柄锈菌16个菌系中呈较低的序列多态性,表明其在条形柄锈菌的进化过程中相对保守。借助荧光假单胞菌EtHAn的三型分泌系统,在小麦细胞中过表达Hasp68能够抑制由非致病细菌引起的PTI（PAMP-triggered immunity）相关胼胝质的积累;同时,也能抑制小麦与无毒条形柄锈菌互作中ETI（effector-triggered immunity）相关的活性氧爆发和过敏性坏死反应,表明效应蛋白Hasp68具有抑制寄主免疫反应的功能。利用酵母双杂交系统筛选Hasp68在小麦中的互作蛋白,发现其与组织蛋白酶B（cathepsin B）TaCTSB互作,双分子荧光技术进一步验证二者在烟草细胞中共表达存在互作,初步揭示了效应蛋白Hasp68的互作靶标。