慢病毒载体的设计及应用进展

慢病毒载体是一类重组逆转录病毒载体,由于其结构和功能的特点作为一种重要的基因转移工具被应用于基因治疗和细胞分子生物学研究领域。目前,为进一步完善慢病毒载体的功能,研究者们从提高载体的生物安全性及增强外源基因的表达调控能力等方面对慢病毒载体进行了改建。本文对慢病毒载体的设计进展及应用进行了简要综述,展望了今后的研究前景。     

炙甘草汤通过抗氧化抑制博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化

摘要 目的：探讨炙甘草汤对特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）小鼠纤维化相关指标的影响,挖掘炙甘草汤治疗IPF的机制。方法：将60只SPF级ICR小鼠随机分为空白组、模型组、吡菲尼酮组和炙甘草汤组,除空白组外,其余组采用气管滴注博莱霉素（5 mg/kg)方法复制IPF小鼠模型,并给予相应的药物治疗。空白组和模型组小鼠灌胃生理盐水,吡菲尼酮组和炙甘草汤组小鼠分别灌胃吡菲尼酮(50 mg/kg)和炙甘草汤（25.4 g/kg）,各组均连续给药4周后取材,记录各组小鼠的死亡情况,计算各组肺系数;观察肺组织切片病理变化;碱水解法检测肺组织羟脯氨酸（HYP）含量;比色法检测肺组织丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性;免疫组化、荧光定量PCR检测α-SMA、COL1A蛋白和mRNA的表达水平。结果：炙甘草汤组小鼠死亡数减少,肺系数显著降低（P＜0.01）,炎性细胞浸润和胶原沉积面积大量减少,肺泡结构逐渐修复,HYP、MDA含量降低（P＜0.01）,SOD活性（P＜0.05）和GSH-Px活性（P＜0.01）显著增强;α-SMA、COL1A蛋白和mRNA表达均降低（P＜0.01）。结论：炙甘草汤通过抑制氧化应激反应,从而抑制成纤维细胞活化,减少细胞质基质沉积,从而减缓IPF疾病进程。     

人PINK1-shRNA载体的构建及对神经母细胞瘤细胞线粒体的影响

摘要 目的：构建筛选人源靶向特异PINK1-shRNA敲减质粒,转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞并验证该质粒转染后对PINK1基因的敲减效率,观察对细胞线粒体形态的影响。方法：构建两对人源PINK1-shRNA序列(编号分别为PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42),将这2对干扰序列连接在载体上形成重组载体,经测序验证后,将空载体和两对敲减质粒分别转染SH-SY5Y细胞,获得基因敲减的细胞模型,用CCK-8法检测细胞的存活率,用荧光定量PCR方法确定PINK1基因的敲减效率,用蛋白质免疫印迹法验证细胞内PINK1的表达水平是否发生改变,用激光共聚焦显微镜观察线粒体的形态是否发生了改变。结果：我们提取的质粒,经测序结果显示,质粒载体构建成功;转染细胞后,CCK-8 法检测细胞存活率发生了降低,与正常组比较,PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42敲减质粒组,细胞的存活率分别降低了13.7%（P＜0.05）和14.1%（P＜0.05）;荧光定量PCR结果显示,与正常组相比,PINK1-shRNA-39组和PINK1-shRNA-42组敲减质粒转染的细胞内PINK1基因的表达分别降低了24.1%（P＜0.01）和36.7%（P＜0.01）;蛋白质印迹法结果显示,与正常组相比,两对质粒分别转染细胞后,PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平降低,差异有统计学意义(P＜0.01),PINK1-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平有效降低更明显;与正常组比较,激光共聚焦显微镜观察到基因敲减两组细胞的线粒体部分发生断裂,碎片较多,基因敲减两组的线粒体的形态因子显著降低,差异有统计学意义（P＜ 0.01）。结论：成功构建了人源的PINK1基因敲减的质粒,并将敲减的质粒成功转染至SH-SY5Y 细胞中,细胞内PINK1基因的mRNA和蛋白的表达水平降低,且细胞线粒体的形态发生了改变。     

免疫磁珠分选降低分化体系中胚胎干细胞的比例

研究目的:采用免疫磁珠分选系统（magnetic activated cell sorting, MACS）分离去除小鼠胚胎干细胞（murine embryonic stem cells, mES）向神经细胞分化时培养体系中的ES细胞,即对分化细胞进行纯化,以期减少移植致瘤性。方法：诱导mES细胞向神经细胞分化,取分化第四期的细胞,胰酶消化制成单细胞悬液,用mES特异性表面抗原SSEA-1（special stage embryonic antigen-1）单抗标记,间接免疫磁珠分选系统分离去除SSEA-1阳性细胞,流式细胞仪检测分选前后细胞中mES细胞的比例,台盼蓝染色检测分选前后细胞存活率。结果：经MACS分选后的阴性细胞中的SSEA-1阳性率可以由分选前的（7.19±1.36）%下降到（1.34±0.80）%,结果具有显著性差异;分选后的细胞存活率仍为92%左右,与分选前存活率无明显变化。结论 用SSEA-1作为表面标志,用MACS方法能有效地去除胚胎干细胞分化细胞中残存的胚胎干细胞,得到高纯度的分化细胞,并且细胞存活率不受影响,为下一步进行移植实验奠定基础。     

小鼠胃 Cajal 间质细胞分离与培养实验方法探讨

目的:尝试优化体外培养Balb/c小鼠胃Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)的实验方法,为深入探索该细胞的生理病理作用机制提供基础。方法:无菌条件下取出小鼠胃组织,使用酶解法消化分离细胞,将细胞悬液接种于含有SCF(干细胞因子)的M199培养基中培养,并进行传代。倒置显微镜下观察不同时间段细胞生长状态,采用ICC特异性标志物c-Kit(酪氨酸激酶受体)进行免疫荧光鉴定。结果:细胞培养24 h后基本已贴壁,呈梭形或三角形,有短突起;72 h后细胞胞体变大,突起伸长;5 d后,细胞之间通过突起彼此相互连接,开始形成网状结构;传代后细胞依然保持其固有特征。免疫荧光鉴定可见细胞c-Kit抗体荧光染色阳性。结论:使用酶解法成功分离细胞,细胞数量较多但不增殖,传代后可见细胞纯度较好,稳定培养3周以上后细胞形态逐渐发生变化并开始凋亡。     

一种基于EdU的体外癌细胞与小鼠体内组织细胞标记方法的研究

摘要 目的：比较EdU标记对三种癌细胞和小鼠对细胞增殖的影响,为EdU作为标记开展相关细胞增殖实验和临床研究提供依据。方法：本研究使用不同剂量EdU对人非小细胞肺癌A549细胞、人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Huh7进行标记2 h,然后使用荧光显微镜观测EdU在细胞中的标记效率,并使用多波长荧光酶标仪检测这三种癌细胞系标记后的荧光强度;使用流式细胞仪检测小鼠经不同剂量的EdU干预12 h后,体内肺、肝、肾组织标记的荧光强度。结果：与对照组相比,经EdU处理后,A549和Hela细胞系的荧光强度,三个剂量组均有显著性差异（P＜0.01）,Huh7细胞系的荧光强度,50 μmol/L有显著性差异（P＜0.05）;EdU在小鼠体内组织肺、肝、肾组织中均有分布,且在肝组织中分布比肺组织和肾组织高。结论：EdU的体外癌细胞与小鼠体内组织细胞的标记效率各不相同,建立的EdU体外标记癌细胞和小鼠体内组织的方法简单,易操作。     

三种固定液对两种氧化应激细胞模型Bclin1和LC3蛋白免疫荧光染色的影响

摘要 目的：比较采用三种不同的固定液对两种氧化应激细胞模型Beclin1和LC3蛋白免疫荧光染色的影响。方法：本研究使用丙酮/甲醇（1:1）固定液、甲醇固定液和4%多聚甲醛三种固定液分别对氧化应激细胞模型大鼠原代心肌成纤维细胞和MCF-7乳腺癌细胞株进行固定,然后再分别进行免疫荧光双染实验,对比三种固定液固定后对自噬关键调控蛋白Beclin1和LC3染色效果。结果：三种固定液对氧化应激细胞模型Beclin1和LC3蛋白免疫荧光染色结果存在较大差异。丙酮/甲醇（1:1）固定液固定后免疫荧光染色效果最佳,细胞结构清晰可见,两种蛋白定位表达清晰,甲醇固定液次之,4%多聚甲醛固定液效果欠佳。结论：在对大鼠原代心肌成纤维细胞和MCF-7乳腺癌细胞进行自噬相关蛋白免疫荧光双染色实验中,在使用其它固定液染色效果不佳的情况下,可以选择应用丙酮/甲醇（1:1）固定液固定,再进行免疫荧光染色;根据不同实验需求相应选择更适宜的固定液,以达到最佳的荧光染色结果。     

麦门冬汤加减方对特发性肺纤维化小鼠PI3K/AKT/mTOR通路的调控

摘要 目的：探讨麦门冬汤加减方对特发性肺纤维化小鼠转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、胶原I(Collagen type I, COL1A)表达的影响以及对PI3K/AKT/mTOR通路的调控作用。方法：将120只SPF级ICR小鼠随机分入空白组、模型组、吡菲尼酮组和麦门冬汤加减方组,用博来霉素(5 mg/kg)建立特发性肺纤维化模型,24 h后分别给予相应的药物治疗。吡菲尼酮组和麦门冬汤加减方组小鼠分别灌胃吡菲尼酮和中药麦门冬汤加减方,空白组和模型组小鼠灌胃生理盐水,各组均连续给药3周(21d)后取材。观察指标：各组小鼠的肺系数;肺组织病理变化;肺组织TGF-β1、α-SMA、COL1A的表达量(免疫组化);肺组织中α-SMA、COL1A、p-PI3K、p-AKT、mTOR的蛋白表达量(Western blot);肺组织中TGF-β1、α-SMA、COL1A的mRNA表达量(qPCR)。结果：模型组小鼠的肺系数显著增加,麦门冬汤加减方组肺系数显著降低;模型组小鼠肺组织中有较多炎性细胞浸润,胶原沉积明显,肺泡结构破坏严重,麦门冬汤加减方组小鼠肺组织病理改变较模型组明显减轻,胶原沉积大量减少,肺泡结构逐渐修复;麦门冬汤加减方组较模型组α-SMA、COL1A、TGF-β1的蛋白表达量显著降低(P＜0.01);麦门冬汤加减方组较模型组α-SMA、COL1A、p-PI3K、p-AKT、mTOR的蛋白表达量显著下调(P＜0.01);麦门冬汤加减方组较模型组α-SMA、COL1A、TGF-β1的mRNA表达量显著降低(P＜0.01)。结论：麦门冬汤加减方能有效改善博来霉素诱导的特发性肺纤维化,降低α-SMA、COL1A、TGF-β1的表达,可能是通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制上皮间充质转化,减少细胞外基质沉积而发挥作用。     

OTX1基因慢病毒载体的构建及过表达研究

OTX1基因是神经发育调控中关键转录因子之一。本实验构建表达OTX1基因慢病毒载体,探讨慢病毒介导OTX1基因体外过表达的可行性。将OTX1基因克隆到慢病毒穿梭质粒DUET101内,构建表达OTX1以及GFP－OTX1基因的慢病毒载体;将pDUET－OTX1、pDUET－GFP－OTX1及pDUET101（空载体对照）质粒分别与慢病毒包装质粒pCMV R8.91、pMD.G共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带OTX1基因、GFP－OTX1基因的重组慢病毒DUET－OTX1、DUET－GFP－OTX1以及仅携带GFP基因的DUET－GFP;用重组慢病毒分别转导293T细胞、SY5Y细胞、小鼠胚胎干细胞及大鼠胚胎15天皮层神经干细胞,证实慢病毒载体能够将外源基因转导入不同细胞,且转导的OTX1或GFP－OTX1在不同细胞中均仅在细胞核内表达;培养OTX1单克隆抗体细胞,浓缩抗体上清,通过Western Blot以及细胞免疫荧光法证实慢病毒介导的OTX1基因及GFP－OTX1基因转导入293T细胞后的过表达。本实验证实慢病毒载体是高效的基因转移载体;OTX1作为发育过程中至关重要的转录因子,经过重组慢病毒体外转导后均只在细胞核内表达。     

含GDNF基因的慢病毒载体的构建和其在人胚胎神经干细胞中的表达

利用含胶质源性神经营养因子(Glial cell derived neurotrophic factor, GDNF)基因的慢病毒(Lentivirus)载体转染了人胚胎来源的神经干细胞, 探讨了转染后GDNF在神经干细胞中的体外表达水平及其影响因素。首先GDNF基因被克隆入慢病毒载体, 通过瞬时转染法包装出病毒上清, 经滴度鉴定后分别按拷贝数分别为 1、2.5、5、10转染神经干细胞。转染后细胞经过潮霉素筛选得到均一表达GDNF的神经干细胞体系。其后分别利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Real-time PCR方法测定不同转染组细胞在不同时间点GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。实验中构建了表达GDNF基因的慢病毒载体, 包装出的病毒上清在体外培养条件下成功转染了神经干细胞, 经潮霉素筛选可以得到均一的持续表达分泌GDNF的人胚胎皮层神经干细胞体系。实验结果表明转染拷贝数可以影响GDNF的分泌水平, 相同条件下转染拷贝数越高, GDNF分泌量越多, 其基因表达水平越高。因此, 含GDNF的慢病毒载体可以成功转染人胚胎来源的神经干细胞, 使其持续表达GDNF, 转染过程中可以通过拷贝数在一定水平上控制GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。