蛇毒类凝血酶calobin在毕赤酵母中的表达

蛇毒类凝血酶是临床上防治血栓栓塞性疾病的有效药物。参照朝鲜蝮蛇(Agkistrodon caliginosus,Korean Viper)类凝血酶calobin基因序列(GenBank AccessionNo.U32937.1),将人工合成的calobin基因克隆到酵母表达载体pPICZαA,于毕赤酵母中表达,得到了分子量约为32kD的重组calobin蛋白,经甲醇诱导培养,表达产物可获得3.5g/L的高表达量。重组蛋白经过阴离子交换柱Q-Sepharose Fast Flow和分子筛Sephacryl-S-100凝胶过滤层析等纯化步骤进行了初步纯化。纯化后的重组calobin可以在纤维蛋白原平板上形成水解圈,经SDS-PAGE实验显示,重组蛋白能水解纤维蛋白原的Aα链,产生一条约40kD左右的降解带。在实验中未能发现重组calobin对纤维蛋白原的凝固作用。     

小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的原核表达及多克隆抗体制备

目的:用原核表达的方法获得带有6个His标记的小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:利用RT-PCR技术,从小鼠心肌组织中扩增出小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件cDNA片段,将该片段与原核表达载体pET-28a连接,构建重组表达质粒pETLG1-3并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组表达菌株。用IPTG诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pETLG1-3表达,SDS-PAGE分析表明在相对分子质量60000处有特异性重组蛋白表达条带,并经Western印迹进一步鉴定。用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备抗小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度。结果:从小鼠心肌组织中克隆了层粘连蛋白α5链LG3组件的基因,并在大肠杆菌得以表达和纯化;制备了重组蛋白的多克隆抗体,其滴度可达到1∶10240。结论:小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能打下了基础。     

移植不同饲料利用效率猪的粪便可定向改变伪无菌小鼠的生长性能

目的通过将不同饲料利用效率猪的粪便移植至伪无菌小鼠,探讨其对受体小鼠生长性能的影响规律,并初步揭示其机制。方法使用36头28 kg左右的杜×长×大阉公猪进行42 d单笼饲养(自由采食)并测算其饲料转化效率。实验结束时将36头猪根据饲料转化效率分为高、中、低3组,采集三组猪的新鲜粪便,通过灌胃移植到经广谱抗生素处理过的小鼠中,监测粪便移植后小鼠的生长性能变化。采用全收粪法测定饲料利用效率高、中、低三组猪的营养物质消化率,并采用16S rRNA V3-4可变区扩增测序对猪和小鼠的粪便微生物组成进行分析比较。结果将不同饲料利用效率猪的粪便移植至广谱抗生素处理的伪无菌小鼠后,小鼠重现了猪的生长性能表型;在肠道微生物的组成结构方面,高饲料转化效率猪及其高生长性能的受体鼠,肠道微生物的物种丰富度和微生物多样性相对较高;高饲料利用效率猪的总能消化率(P=0.01)显著增加,产气短杆菌的丰度显著提高,且其粪便移植后受体小鼠的肠球菌和阿克曼氏菌丰度也显著高于低饲料利用效率的受体小鼠,表明肠道微生物在能量的高效利用方面起着重要的作用。结论移植不同饲料利用效率猪的粪便可定向改变伪无菌小鼠肠道微生物的物种丰富度、微生物多样性及其生长性能。高饲料利用效率猪的优势主要在于能量消化利用效率较高,肠道中与能量高效利用相关微生物丰度相对较高。     

炭疽芽孢杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及纯化

按照炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因成熟肽编码序列设计引物,从炭疽杆菌pOX1质粒中扩增出PA基因片段,将该片段定向插入到原核表达载体pET-28a中,获得了pET-PA原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为PA基因的成熟呔编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,重组蛋白在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达;Western印迹分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。     

炭疽菌保护性抗原受体结合区的表达及其多克隆抗体的制备

原核表达炭疽杆菌保护性抗原受体结合区并制备该蛋白的多克隆抗体.从炭疽芽胞杆菌A16R中经PCR扩增得到了炭疽菌保护性抗原(PA)受体结合区基因,即PA的第四结构域(PA-D4),将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-2b(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrapTM Chelating HP柱纯化重组蛋白,Western blot进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原,免疫新西兰大耳白兔制备该蛋白的多克隆抗体;用ELISA和Western blot检测抗血清.结果表明,目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对PA-D4融合蛋白的高效价抗血清,ELISA抗体滴度为1∶ 102 400;其抗体能特异性识别内源性的PA.PA-D4重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能和炭疽疫苗免疫保护机制奠定了基础.     

应用生物信息学方法筛选幽门螺杆菌疫苗候选抗原

目的：应用生物信息学分析方法筛选幽门螺杆菌新的疫苗候选抗原。方法：从TIGRCMR下载幽门螺杆菌26695和J99株全基因组序列,应用生物信息学SignalP、PredTMBB、LipoP、TMHMM、Phobius、PSORT-B和SubLoc等分析软件,筛选幽门螺杆菌新的外膜蛋白和分泌蛋白疫苗候选抗原。结果：从幽门螺杆菌26695株筛选得到54个编码β-桶型跨膜蛋白、脂蛋白或分泌表达蛋白的疫苗候选蛋白抗原,从幽门螺杆菌J99株得到61个呈现上述表达方式的疫苗候选蛋白抗原;且这2株细菌的疫苗候选蛋白呈现良好的交集状况,即有43个候选疫苗蛋白是相同的。结论：用生物信息学分析方法可以从全基因组范围内快速筛选到保守的分泌或表面暴露的疫苗候选抗原,为疫苗抗原的快速筛选与鉴定奠定了基础。     

利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌rfaH基因

目的：利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌的rfaH基因。方法：以伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi Ty2,S.ty2）基因组为模板扩增得到的同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段共同构建同源重组载体;以重组载体为模板扩增打靶片段,将其转化S.ty2;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,打靶片段和菌体基因组发生同源重组,通过卡那抗性筛选得到带有抗性标记的重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以去除抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;通过PCR鉴定重组菌,并经透射电子显微镜分析表型。结果：在S.ty2中敲除了rfaH基因,经PCR扩增和序列测定正确;初步的表型分析表明突变体的鞭毛合成显著减少。结论：获得了S.ty2突变株,为将沙门氏菌进一步减毒成为疫苗表达载体奠定了基础。     

小鼠层粘连蛋白α5 LG3组件的表达及纯化

目的:用原核表达的方法获得带有6×His标记的小鼠层粘连蛋白α_5 LG3组件的重组蛋白。方法与结果:从小鼠心肌组织中提取总RNA,利用RT-PCR扩增出小鼠层粘连蛋白α_5 LG3组件的cDNA片段,并与pET-28a载体连接,构建重组表达质粒pET-LG3,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为小鼠层粘连蛋白α_5 LG3组件基因的成熟肽编码序列。用IPTG诱导,LG3蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了表达,并经Ni-NTA层析柱获得纯化。结论:层粘连蛋白α_5 LG3组件的重组蛋白得到表达和纯化,为后续相关研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备稳定分泌抗幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定。方法:用初步纯化的重组幽门螺杆菌尿素酶B免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备抗尿素酶B的mAb,用间接ELISA检测mAb的特异性和亲和力,检测mAb腹水效价,鉴定Ig亚类并测定其抗原决定簇。结果:获得8株能稳定分泌抗尿素酶B的mAb杂交瘤细胞系,这8株单抗与能产生尿素酶的小肠结肠耶尔森氏菌、肺炎克雷伯氏菌和普通变形杆菌均无交叉反应,相对亲和力为1.13×10-8～4.66×10-10,腹水mAb效价可达2×104～3.2×105。其中2株单抗属IgG1亚类,3株单抗属IgG2a亚类。8株单抗分属于3种不同的抗原决定簇。结论:获得了IgG1和IgG2a类型的针对3种不同抗原决定簇的特异性幽门螺杆菌尿素酶B的mAb,为进一步用于幽门螺杆菌的临床诊断和实验研究创造了条件。     

炭疽芽胞杆菌疫苗研究进展

炭疽芽胞杆菌引起的炭疽病死亡率非常高 ,当前的疫苗具有效力不稳定、对吸入性炭疽的保护率低、免疫程序繁琐、存在副作用等缺点。近年来人们在改造传统疫苗的同时又有一些新的发现 ,如保护性抗原 (PA)的抗体在体内可杀死芽胞 ;通过粘膜免疫能够诱导机体分泌IgA抗体 ;抗多聚谷氨酸 (γ D PGA)抗体可以同炭疽杆菌的繁殖体作用 ,从而杀死繁殖体 ;寻找到新的免疫原。DNA疫苗、活载体疫苗的出现为新一代安全、免疫程序简单、具更高保护率的疫苗奠定了基础