教酒链霉菌NRRL 3882中钙霉素生物合成后修饰基因calD的功能分析

【目的】钙霉素是二价阳离子载体,是一类含有吡咯环的聚醚类抗生素,广泛用于细胞二价阳离子的生物学功能研究。本文以钙霉素生物合成基因簇中cal D基因为研究对象,通过蛋白质同源序列比对、基因敲除、回补验证及HPLC/MS分析,对cal D基因的功能进行表征。【方法】对cal D基因功能进行生物信息学预测。选用钙霉素产生菌Streptomyces chartreusis NRRL 3882,通过PCR-targeting的方法对cal D基因进行敲除获得突变株,再将cal D基因克隆到链霉菌整合质粒上,通过接合转移技术将cal D回补到缺失株中。使用HPLC/MS技术对菌株发酵产物进行分析。【结果】生物信息学预测Cal D蛋白酶属于氧化还原酶。获得cal D基因敲除突变株Δcal D及基因回补菌株Δcal D:cal D。HPLC/MS检测到cal D基因的缺失菌株大幅降低钙霉素产生能力,与野生型菌株相比,突变株中积累更多的3-Hydroxylcezomycin和更少的氮-去甲基钙霉素。【结论】cal D参与钙霉素的生物合成。cal D的缺失导致3-Hydroxylcezomycin的积累,推测cal D负责钙霉素生物合成途径中苯并噁唑环3位上羟基转化成酮基的氧化反应。初步阐明了cal D基因在钙霉素生物合成途径中的功能机制。     

过表达调控基因rapG提高雷帕霉素的产量

雷帕霉素是具有很好的抗真菌、免疫抑制、抗肿瘤等活性的微生物次级代谢产物,可由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)发酵产生。由于传统诱变育种的菌株产量较低,不能满足工业生产的需求。为了找到突破传统育种瓶颈的技术方法。本研究通过建立该菌株的遗传操作体系、构建表达载体、建立发酵、提取和检测等的研究方法,对传统诱变菌株(S.hygroscopicus17-1)进行遗传改造。首先,以整合型载体pSET152为出发载体,构建了含有自身启动子的rapG调控基因表达载体,建立并优化了该菌株的遗传操作系统,通过大肠杆菌与链霉菌属间接合转移的方法成功将rapG整合至原菌株基因组上,获得了该基因的多拷贝菌株S.hygroscopicus17-Gp。采用高压液相色谱和质谱等方法,检测分析了S.hygroscopicus17-1与S.hygroscopicus17-Gp发酵液中雷帕霉素的产量。结果表明S.hygroscopicus17-Gp发酵液中雷帕霉素的产量比原菌株提高了约40%,这为后期进行相关机制和产量提高的理论与实践研究奠定了基础。     

新的产弹性蛋白酶菌株的筛选与鉴定

本研究从秸秆中分离得到一株弹性蛋白酶高产菌, 并对该菌株进行鉴定, 以期为实现其工业化生产提供理论依据。采用酪蛋白(脱脂奶粉)进行初筛后, 以弹性蛋白(牛筋)进行复筛, 并对筛选结果进行检验, 然后对所得菌株结合形态、生理生化特性和16S rRNA基因序列进行分类鉴定, 得到一株弹性蛋白酶高产菌株LSF-97。结果显示, 菌株LSF-97与短小芽孢杆菌同源率达到100%, 形态及生理生化特征与模式菌也显示高度一致性, 故将其确定为短小芽孢杆菌。     

气象因素对陕西省苹果褐斑病流行的影响及预测模型

基于对1999-2008年陕西省气温、相对湿度以及陕西省苹果主产区苹果褐斑病发生、流行的监测,对苹果褐斑病发生时间、发病规律及流行程度进行了分析,并构建了旬平均气温(T)和旬平均相对湿度(Hm)影响下苹果褐斑病一维和三维动态预测模型.结果表明：研究区苹果褐斑病受环境因素影响严重,7、8月在田间扩展迅速并引起大量落叶,危害可持续至9月,初霜后不再有新病斑扩展;构建模型所用的T和Hm与田间实际条件基本一致,苹果褐斑病三维动态预测模型为：f(T,Hm)=-0.0172T³+0.9497T²-16.2209T+88.9923-0.00001Hm³+0.00354Hm²-0.15554Hm+2.36578［f(T,Hm)为病情指数］.模型结果表明,田间引起苹果褐斑病发生的T为15 ℃,大流行条件为7、8月T为 23 ℃、Hm在90%以上.     

瑞拉菌素产生菌RL-2的诱变育种

本研究以委内瑞拉链霉菌秦岭变种RL-2(Streptomyces venezuelaevar. qinlingensis RL-2)为出发菌株, 分别采用紫外线、氯化锂及紫外线加氯化锂的复合诱变方式对其孢子悬液进行诱变处理。在复合诱变的紫外线照射时间为45 s和氯化锂浓度为0.4%的情况下, 获得一株瑞拉菌素的高产突变菌株UVL-108且连续传接6代其遗传特性较稳定。采用双向培养及生长速率法对其进行初筛和复筛, 结果表明: UVL-108的拮抗性能较出发菌株提高了77%, 其发酵液对稻瘟病菌的抑菌毒力是出     

瑞拉菌素产生菌GAO-1-GR-2发酵工艺条件优化研究

对瑞拉菌GAO-1-GR-2的发酵条件进行了单因素研究,通过正交试验设计对该菌株的培养基进行了筛选。并对其发酵条件进行了研究,结果表明：有机氮源以酵母粉和黄豆饼粉为宜;碳源以葡萄糖和饴糖最好,但考虑到发酵成苓,应选用葡萄糖2％。发酵培养基应呈中性,以采用自然pH为宜,pH超过8,或小于7,则会抑制发酵产物活性;通气量为1：0．5最好,能降低20％耗氧量;摇床转速140r／min,培养温度30℃,发酵周期72h。抗生素发酵原粉效价能达到4000μg／mL。     

卡西霉素生物合成调控基因calR2的功能

【背景】卡西霉素(Calcimycin)是由教酒链霉菌NRRL3882产生的吡咯聚醚类抗生素,结构独特且具有广泛的生物活性,但其生物合成调控机制尚不清楚。【目的】研究卡西霉素生物合成基因簇上编码LuxR家族同源蛋白的潜在调控基因calR2的功能。【方法】通过PCR-targeting的方法对卡西霉素基因簇上的calR2基因进行中断,HPLC对突变株及回补菌株的代谢产物进行分析。利用荧光定量RT-PCR分析ΔcalR2突变菌株和野生菌株的基因转录水平差异。【结果】calR2基因中断的突变株不能产生卡西霉素,回补菌株则恢复产生卡西霉素的能力。RT-PCR结果表明卡西霉素生物合成的一些重要骨架基因在ΔcalR2突变株中的转录水平明显降低。【结论】LuxR家族转录调控基因calR2在卡西霉素生物合成过程中起正调控作用。     

卡西霉素生物合成基因簇中调控基因calR1的功能

【背景】卡西霉素(calcimycin)是重要的离子载体抗生素,其生物合成基因簇已从教酒链霉菌NRRL3882的基因组DNA中成功克隆,但基因簇内的部分生物合成基因及调控基因的功能有待研究。【目的】研究卡西霉素产生菌教酒链霉菌NRRL3882中编码TylR家族同源转录调控蛋白的calR1基因的功能。【方法】通过PCR-targeting的方法,构建calR1基因敲除突变株及回补菌株,对突变菌株及回补菌株进行发酵,通过HPLC分析其代谢产物。利用荧光定量PCR检测ΔcalR1突变菌株和野生菌株的生物合成基因转录水平。【结果】calR1基因敲除突变株丧失产生卡西霉素的能力,但仍有中间产物噻唑霉素的积累,回补菌株中卡西霉素的产量有一定程度的恢复。RT-qPCR结果表明,卡西霉素合成相关的一些重要基因calC、calG、calU3等基因的表达量明显改变。【结论】TylR家族转录调控基因calR1是卡西霉素生物合成的调控基因。     

小鼠精子发生早期microRNA的表达谱和调控模式——miRNA在小鼠精子发生中的作用

精子发生是一个依赖于精原干细胞自我更新和精原细胞分化的精确而又复杂的调控过程,目前对这一过程知之甚少.mi RNA作为转录和转录后基因沉默的关键调节子,参与很多生物的多种发育过程.本研究采用高通量小RNA测序系统研究了mi RNA在小鼠B型精原细胞(BSc)和初级精母细胞(PSc)中的表达谱.结果显示,在这2种细胞类型中let-7mi RNA家族的表达水平都相当高.并且在BSc向PSc的转化过程中,mi R-21,mi R-140-3p,mi R-103,mi R-30a,mi R-101b和mi R-99b的表达水平明显降低.这些mi RNA参与调控与细胞凋亡、细胞增殖和分化、连接组装和细胞周期调控相关的诸多基因的表达.上述结果表明,mi RNAs在精子发生过程中发挥着不可替代的作用.