新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用

用RT-PCR方法扩增出新城疫病毒标准强毒株F48E8的F基因,并将其克隆到pGEM-T载体,命名为pGEM-NDF。鉴定正确后,以BamHI和XbaI双酶切将F基因从pGEM-NDF中释放出来,并插入到pFastBacI载体中,得到重组转移载体pFast-NDF。然后将该重组质粒转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中,通过转座作用获得重组穿梭质粒reBacmid-NDF。再用reBacmid-NDF转染Sf9昆虫细胞,获得含有新城疫病毒F48E8株F基因的重组杆状病毒。间接免疫荧光和Western-blot分析结果表明F蛋白在昆虫细胞中获得表达,而且主要表达于细胞膜上,并使感染重组杆状病毒的昆虫细胞在96h发生融合作用。动物试验表明,表达的F蛋白能够产生中和抗体。本文的研究结果为F蛋白的进一步开发奠定了基础。     

新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用

用RT-PCR方法扩增出新城疫病毒标准强毒株F48E8的F基因,并将其克隆到pGEM-T载体,命名为pGEM-NDF.鉴定正确后,以BamHI和XbaI双酶切将F基因从pGEM-NDF中释放出来,并插入到pFast Bac I载体中,得到重组转移载体pFast-NDF.然后将该重组质粒转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中,通过转座作用获得重组穿梭质粒reBacmid-NDF.再用reBacmid-NDF转染Sf9昆虫细胞,获得含有新城疫病毒F48E8株F基因的重组杆状病毒.间接免疫荧光和Western-blot分析结果表明F蛋白在昆虫细胞中获得表达,而且主要表达于细胞膜上,并使感染重组杆状病毒的昆虫细胞在96h发生融合作用.动物试验表明,表达的F蛋白能够产生中和抗体.本文的研究结果为F蛋白的进一步开发奠定了基础.     

安徽省猪圆环病毒2型毒株的分离与鉴定

目的从病原学角度了解安徽省猪群中PCV2的感染情况。方法PCR检测临床疑似PCV2感染的病料,阳性病料接种于PK15细胞中进行PCV2的分离和增殖,再经PCR检测、间接免疫荧光试验、电镜观察,以及ORF2基因序列分析等鉴定。结果9份临床病料中均扩增出630bp的PCV2特异性DNA片段,分离鉴定获得5株PCV2,分离毒株之间及其与27株国内外参考毒株之间的ORF2基因序列同源性在87.3%～99.8%。结论首次从病原学角度证实安徽省猪群中PCV2感染的普遍存在,分离毒株与国内外参考毒株的同源性均较高。     

安徽PRSS发病猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其耐药性分析

目的了解猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）发病猪继发感染副猪嗜血杆菌（HPS）的情况及分离菌株的药物感受性。方法应用细菌分离培养、形态学检查、生化试验和PCR技术,对2007年1月至2008年12月从安徽不同地区采集的146头份PRRS发病猪的病料进行HPS检测,并采用标准K-B纸片法对分离菌株进行14种抗菌药物敏感试验。结果分离鉴定出12株HPS,检出率为8.22%（12/146）;12株HPS对氯霉素100%敏感,环丙沙星为91.7%,阿莫西林和新霉素为83.3%,对罗红霉素100%耐药,阿米卡星为83.3%。结论安徽省不同地区PRRS感染猪群中均存在程度不同的HPS感染,各地区HPS分离株表现出形态上的变化特征和一致的生化特性,且有对临床常用抗菌药物耐药性增强的趋势。     

环状RNA与病毒感染之间相互关系的研究进展

非编码RNA (non-coding RNA,ncRNA)是指一类不具有编码蛋白质功能的RNA,包括转运RNA (transfer RNA,tRNA)、核糖体RNA (ribosomal RNA,rRNA)、微小RNA (micro RNA,miRNA)、长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)以及环状RNA(circular RNA,circRNA)等.近年来circRNA在癌症,肿瘤以及心脑血管疾病等多种疾病中被证实发挥重要作用,此外研究还发现宿主circRNA与病毒来源的cicrRNA均会参与到病毒感染进程,但其中circRNA发挥的功能还有待进一步研究,因此,该文综述了circRNA的发现、分类、主要功能以及宿主circRNA和病毒来源的circRNA与病毒感染之间相互关系的研究进展,将有助于理解circRNA与病毒感染之间的互作机制.     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的用RT-PCR技术扩增鸭坦布苏病毒(DTMUV)AH-F10株E基因,并克隆至pET32a(+)载体,构建重组表达质粒pET32a-E,表达E蛋白。方法重组表达质粒转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导后,获得含6个His标签的融合蛋白,大小约54kDa。表达的蛋白以包涵体形式存在。对目的蛋白进行纯化,用纯化的E蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体血清。结果SDS-PAGE和Western blot试验结果表明E基因在大肠埃希菌中成功表达,并能与抗DTMUV多克隆抗体产生特异性反应,具有良好的反应原性。间接免疫荧光试验表明免疫小鼠后获得的多克隆抗体能与DTMUV反应。结论本研究为DTMUV新型疫苗和诊断试剂盒的进一步研究奠定了基础。     

2种气管黏膜上皮细胞体外培养技术的研究

目的为以猪气管黏膜上皮为细胞模型的研究奠定物质基础,进一步探讨猪气管黏膜上皮细胞的体外传统培养和气液界面培养技术,从而使2种培养技术优势互补。方法对猪气管上皮分离、纯化、培养和传代,并探索上皮细胞最佳冻存复苏条件;复苏后的气管上皮细胞进行气液界面培养,绘制细胞生长曲线和观察细胞纤毛生发情况。利用免疫组化法鉴定上皮细胞。结果4步纯化法可以得到高纯度的气管上皮细胞。使用胎牛血清、DMEM/F12培养液和DMSO的体积分数为50%、40%和10%的冻存体系保存的气管上皮,复苏后细胞存活率平均可达89%。优化后的传统方式培养的上皮细胞可连续传代到第8代,但从第2代开始便观察不到纤毛,转换成气液界面连续培养2代后重新生发纤毛,细胞存活期延长。免疫组化结果显示分离培养细胞为上皮细胞。结论成功建立了2种猪气管上皮细胞培养技术,并找到适宜的气管上皮细胞冻存条件,节省了不断原代取材的成本和时间,并成功实现传统培养细胞冻存复苏后很快适应气液界面的培养并恢复细胞的天然结构,为猪气管黏膜上皮相关研究提供丰富的细胞来源。     

健康猪直肠粪便中沙门菌I类整合子与耐药基因的检测

目的了解安徽省规模化猪场健康猪直肠粪便中沙门菌分离株多重耐药情况及其与I类整合子和耐药基因的携带关系。方法采用标准K-B纸片法对22株沙门菌分离株进行15种抗生素敏感试验;应用PCR技术对沙门菌分离株进行I类整合子及耐药基因检测。结果 22株沙门菌分离株中有20株(90.91%)对2种以上抗生素耐药,属于多重耐药株,羧氨苄青霉素-四环素-卡那霉素-氯霉素-氟苯尼考是主要多重耐药谱;22株沙门菌中有19株(86.4%)携带I类整合子,tetB、aph(3)-IIa和cmlA基因分别检出最高。结论沙门菌多重耐药性与整合子携带之间的关系密切,耐药表型测定结果与耐药基因检测结果基本一致,基因组DNA携带的耐药基因种类多于质粒。     

血清2型鸭疫里默氏杆菌脂多糖单克隆抗体的研制及特性鉴定

【背景】鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)可感染雏鸭、鹅、火鸡等多种禽类,引起急性或慢性传染病。RA血清型众多且各血清型之间缺乏有效的交叉保护。细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)位于革兰氏阴性菌细胞壁的外侧,其组成和结构变化决定了细菌表面抗原决定簇的多样性。【目的】制备血清2型鸭疫里默氏杆菌LPS单克隆抗体并对其特性进行研究。【方法】以血清2型RA NJ3株免疫BALB/c小鼠,细胞融合后以RA NJ3株LPS作为包被抗原,筛选出能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过体内诱生腹水法制备抗体,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测单克隆抗体效价,玻片凝集试验和Westernblot检测单抗特异性。【结果】获得两株能稳定分泌抗血清2型鸭疫里默氏杆菌LPS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为8G5和8G10;两株单抗的亚型均为IgM/κ链。ELISA结果表明,8G5和8G10腹水效价分别为1:32 000和1:16 000。Western blot结果显示,两株单抗仅与血清2型RA菌株发生特异性反应,而与其他血清型RA菌株和禽源致病菌无反应性。【结论】研究获得的单克隆抗体具有良好的反应性和血清型特异性,可用于RA致病机制的基础研究和进一步建立RA血清型快速检测方法。     

J亚群鸡白血病病毒AH09/2株的gp85基因的克隆与原核表达

利用PCR方法扩增出J亚群禽白血病病毒(ALV-J)AH09/2株的gp85基因全长930 bp DNA片段。经T载体克隆测序并连接到pGEX-6p-1载体上,构建了重组表达质粒pGEX-6P-1-gp85,在IPTG的诱导下进行表达。Western-blot结果分析表明,gp85融合蛋白表达产物分子量大小约61 kDa,并能与ALV-Jenv基因单抗发生特异性反应。这些结果为深入研究GP85蛋白的生物学功能及研制ALV-J检测ELISA试剂盒奠定了基础。