工程菌种自动化高通量编辑与筛选研究进展

合成生物学(synthetic biology)与经典生物学研究的革命性区别之一是合成生物学能将生物实验的对象、方法、技术和流程高度标准化和模块化,创建出自动化与高通量的合成生物铸造模式。该模式通过复杂生物过程与自动化设施的结合,颠覆过往劳动密集型的研究范式,获得更高的技术迭代能力,极大促进了合成生物学的发展和产业化应用。值此天津工业生物技术研究所创立10周年之际,本文回顾了研究所在工业菌种自动化高通量编辑与筛选领域的系列重要工作进展,对基因克隆(gene cloning)、基因组编辑(genome editing)、编辑序列设计(editing sequence design)等生物技术的自动化实现,以及流式细胞、液滴微流控、全基因组规模扰动测序等高通量筛选技术进行了分析讨论,并展望了本领域未来的发展方向。望借此为创建具有自主知识产权的优秀菌种及其产业应用提供智能化、自动化和全链条覆盖的整体支撑能力。     

微水相中杏仁醇腈酶催化不对称合成(R)-氰醇的研究

利用气相色谱手性分析,研究了微水相中来源于杏仁的(R)-醇腈酶催化醛与HCN不对称合成(R)-氰醇.结果表明,反应时间、添加乙酸、反应介质、反应体系水活度、反应温度和底物的结构对醇腈酶反应均有显著影响.杏仁醇腈酶对芳香族、脂肪族和杂环族醛均有良好的催化作用.其中,苯甲醛为杏仁醇腈酶的最适作用底物,在低温（0～5℃）下,转化率和产物对映体过剩值均在99%以上.     

工业酶与绿色生物工艺的核心技术进展

绿色生物工艺是国家战略性新兴产业,具备高效、安全、节能、环保等特点,市场前景广阔。工业酶是绿色生物工艺的“芯片”,新型高效工业酶的开发与应用相关技术是绿色生物工艺的核心。文章综述了工业酶制剂产业现状、以中国科学院天津工业生物技术研究所为代表的研发机构在工业酶及绿色生物工艺开发应用方面产生的一系列关键技术突破与研发进展,展示了通过酶与生物技术的进步提升传统加工产业发展的典型案例,随着这些核心技术的发展将推动越来越多的传统制造业走向绿色可持续发展路线。     

体外循环血浆对类中性粒细胞趋化和CXCR4表达的影响

为研究体外循环血浆对类中性粒细胞趋化功能和CXCR4表达的影响,选择体外循环下心内直视手术(CPB组)和超声引导下外科微创室间隔缺损封堵术(N-CPB组)的患儿各12例,收集手术前后血浆,采用Transwell细胞培养系统测定其对体外培养的类中性粒细胞的趋化效应,并采用流式细胞术和Western blot测定经血浆刺激后类中性粒细胞表面趋化因子受体4[chemokine(C-X-C motif)receptor 4,CXCR4]蛋白质及其磷酸化水平的变化,运用RT-q PCR检测CXCR4 m RNA水平。结果表明,CPB血浆对类中性粒细胞趋化效应明显增强,T1和T2时刻趋化指数分别为3.89±0.77和7.68±1.55,CXCR4特异性拮抗剂AMD3100对这一增强效应有抑制作用;CPB血浆刺激后,类中性粒细胞表面CXCR4蛋白质及其磷酸化水平均明显升高,但其m RNA水平未发生明显变化。体外循环血浆可激活类中性粒细胞CXCR4信号通路,其机制与增加细胞表面CXCR4蛋白质及其磷酸化水平有关,但与其m RNA水平无关,这一机制可能与体外循环过程中中性粒细胞向肺部和其他血管外组织浸润有关。     

液滴微流控芯片系统中微液滴特性表征及氨基酸检测应用

基于液滴微流控芯片的检测和筛选系统,因其具有通量高、成本低等显著特点,近年来备受关注。该系统生成的微液滴(皮升体积)具有直径均一、大小可控、互不交融(单分散性)等特性,它作为微反应器可以进行微生物及其代谢物包埋实验和高通量检测。因此,研究微液滴的相关特性及其应用具有重要意义。文中在液滴微流控芯片系统搭建的基础上,对重要氨基酸(谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)分别进行了微液滴包埋实验,研究了包埋微液滴的重要特性参数(如稳定性、扩散性等),探索了包埋微液滴对氨基酸检测分选的应用。实验表明,文中搭建的液滴微流控芯片系统可以稳定、均一地生成微液滴,微液滴大小可根据需要控制在2 0-5 0μm之间,微液滴间无交叉污染,包埋氨基酸的微液滴的检测筛选速度大约为每分钟6 0 0个。这个研究为高通量分析和筛选产氨基酸的微生物奠定了基础。     

核黄素工业菌株高通量筛选方法的建立和应用

枯草芽孢杆菌是主要的核黄素工业生产菌之一,高通量筛选技术是选育获得高产核黄素菌株的关键环节。为实现工业菌种选育与高通量筛选技术相结合,对流式细胞分选、液滴微流控分选和96孔板筛选在核黄素工业菌株筛选中的应用进行了研究,并对96孔板筛选方法进行了优化。在流式细胞分析中,来源于同一株工业菌的低产菌株P1与高产菌株R1的细胞荧光与核黄素产量不成正相关。在液滴微流控分析中,P1和R1的发酵液上清荧光与核黄素产量成正相关,然而液滴分选后活细胞的数量很少。在96孔板筛选实验中,振荡培养后P1和R1的发酵液荧光分别为22 264 a.u.、28 647 a.u.;静置培养后荧光分别为7 095 a.u.、10 189 a.u.,核黄素产量与荧光成正相关,且二者荧光差异显著。利用96孔板静置培养的方法对工业菌株S1的突变体库进行筛选,得到的优选菌株核黄素产量为2.53 g/L,相比S1提高了15%。这些结果表明96孔板静置培养-荧光检测筛选可以应用于核黄素工业生产菌产量的提高。     

微水相中杏仁醇腈酶催化不对称合成(R)-氰醇的研究

利用气相色谱手性分析,研究了微水相中来源于杏仁的（R）－醇腈酶催化醛与HCN不对称合成（R）－氰醇,结果表明,反应时间,添加乙酸,反应介质,反应体系水活度,反应温度和底物的结构对醇腈醇反应均有显著影响,杏仁醇腈酶对芳香族,脂肪族和杂环族醛均有良好的催化作用,其中,苯甲醛为杏仁醇腈的最和达作用底物,在低温（0－5℃）下,转化率和产物对映体过剩值均为99％以上。     

同一生境下白及与黄花白及内生菌群差异的初步研究

为揭示白及与黄花白及内生菌群落特征异同的内在机制,该文运用末端限制性酶切片段长度多态性分析技术对白及和黄花白及叶、茎、块茎、根等组织中内生细菌16S rDNA、内生真菌ITS区进行检测,分析内生菌丰度及多样性指数,运用主成分分析、聚类分析和相关性分析对比白及与黄花白及内生菌差异。结果表明:(1)白及和黄花白及各组织内生细菌H指数为1.77～2.51,内生真菌H指数为1.79～3.18。(2)内生细菌表现为茎、块茎和根中相似,叶中差异较大; 内生真菌则表现出明显的特异性。(3)白及药用部位多糖含量与内生细菌中的7个T-RFs、内生真菌中的2个T-RFs呈相关性,黄花白及药用部位多糖含量与内生细菌中的3个T-RFs、内生真菌中的6个T-RFs呈相关性。综上结果表明,同一生境下,白及和黄花白及内生细菌除叶组织外,其他组织相似,内生真菌则差异显著,部分内生菌和药用部位多糖含量存在相关性。     

大肠杆菌合成启动子的构建及在顺,顺-粘康酸生物合成中的应用

启动子是基因表达调控的重要元件.在代谢工程和合成生物学研究中,经常需要利用不同强度的启动子对代谢途径进行精细调控,来实现代谢平衡,降低中间产物积累,提高目标产物合成.然而目前可获得的启动子难以满足以上要求,而且不同来源的启动子通用性差,缺乏标准化.针对这些问题,设计了1条88个碱基对的启动子,包含典型的-35区、-10区以及核糖体结合区.同时,在转录起始位点上游6个碱基、-35与-10区间隔区14个碱基对中引入简并序列,构建了合成启动子文库.利用合成启动子控制红色荧光蛋白mCherry的表达强度,经过两轮筛选,从5 000多个克隆中获得了720个不同强度的启动子.随机挑选35条不同强度的启动子进行测序分析,结果表明不同强度的启动子具有碱基偏好性.对于强启动子,-13位点嘌呤碱基出现频率高,转录起始区除-4位点外,嘧啶碱基出现的频率高于嘌呤碱基,而-10区与-35区间14个位点的嘌呤碱基与嘧啶碱基出现频率大致相当.最后选取5条不同强度启动子应用于顺,顺-粘康酸合成途径调控优化,结果显示不同强度的启动子可以调节目标产物顺,顺-粘康酸的合成和中间产物儿茶酚的积累.     

嗜热毁丝霉高通量培养技术及其应用

【背景】丝状真菌是一类重要的工业发酵生产宿主菌,如何进行高通量纯菌培养和高效检测筛选性能优异的菌株是工业丝状真菌研究的重要方向。【目的】研究建立丝状真菌的高通量培养技术并测试应用效果。【方法】通过对丝状真菌培养过程中的制种、接种、培养和检测研究,建立基于孔板的高通量培养技术,并以嗜热毁丝霉为例对该技术进行验证。【结果】与传统的平板制种和摇瓶接种培养方式相比,高通量孔板的培养方式将制种通量提高24倍,单位面积产孢子能力提高350%,液体培养转接效率提高10-40倍,并建立96孔板测定乙醇含量的高通量检测技术。【结论】将丝状真菌的培养和检测通量提高1-2个数量级,为快速检测丝状真菌改造过程产生的大量性状不同菌株并获得目标菌株奠定基础,为丝状真菌高通量筛选研究提供应用指导价值。