单增李斯特菌溶血素(LLO)的原核表达及其生物学活性鉴定

利用生物软件设计单增李斯特菌溶血素蛋白的基因hly的引物,通过PCR扩增hly基因,并将其克隆至PET28a(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21进行优化表达。用镍柱纯化表达产物LLO,通过免疫印记鉴定其免疫原性,并通过溶血实验鉴定其溶血活性。琼脂糖凝胶电泳结果表明PCR扩增出1 590 bp的片段,经测序鉴定其序列同源性可达99%。SDS-PAGE结果表明诱导表达的产物大小约为58 kD,其最优化的表达条件是28°C下用0.1 mmol/L IPTG诱导6 h。Western blotting结果表明重组表达的LLO具有免疫原性;溶血实验表明重组表达的LLO具有较强的溶血活性,其溶血效价可达1:1 024。这为制备针对单增李斯特菌的单克隆抗体及其检测方法的建立奠定了基础。     

单增李斯特菌InternalinA的表达、纯化及多克隆抗体的制备

【目的】克隆表达单增李斯特菌膜表面蛋白InternalinA(InlA),经免疫家兔获得多克隆抗体,为建立其免疫磁珠富集快速检测方法奠定基础。【方法】利用生物软件设计单增李斯特菌inlA基因的引物,通过PCR扩增出inlA基因,并将其克隆至pET28a()原核表达载体,转化大肠杆菌BL21进行优化表达。镍柱纯化表达产物,质谱鉴定重组蛋白,ELISA分析其免疫原性。免疫家兔,制备其多克隆抗体。间接ELISA检测多抗的效价及交叉性,免疫荧光分析多抗与单增李斯特菌菌体结合的特异性。【结果】成功表达了InlA蛋白,融合表达产物分子量约为92 kD,质谱鉴定其为InlA蛋白;免疫家兔获得的抗血清效价为1:100 000,除与金黄色葡萄球菌约20%的交叉外,与副溶血弧菌等其它病源菌均无交叉;免疫荧光证实该多抗特异性结合于单增李斯特菌膜表面,与同种属的威尔斯李斯特菌不结合。【结论】成功制备了单增李斯特菌特异性的兔多克隆抗体,为单增李斯特菌免疫磁珠富集快速检测方法的建立奠定了基础。     

高等植物开花时程的基因调控(Ⅱ)

主要探讨如下几个问题:转基因植物中的拟南芥开花时程基因;拟南芥中的甲基化与实验胚胎学研究;高等植物开花时程控制的可能机制.目前本领域已成为植物发育分子生物学的前沿热点研究领域之一.结合有关工作,对这一世界性热门领域进行了系统的评述,希望能为国内同行提供有关参考,赶超世界的植物分子生物学先进水平,对分子水平与生物技术角度改良黄土高原生态环境有指导意义.     

免疫磁珠富集技术联合选择性培养基快速检测单增李斯特菌

单增李斯特菌是一种危害极大的食源性致病菌,建立快速及特异的检测方法对于食品安全监控尤为重要。文中联合免疫磁珠与选择性培养基对不同浓度(101~105CFU/mL)单增李斯特菌进行检测,并对3种李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌进行交叉试验;同时模拟食物污染,探索免疫磁珠-平板法检测样品的检测限以及该方法的最快检测时间。结果显示特异性免疫磁珠联合选择性平板法可检出浓度为103CFU/mL及以上的单增李斯特菌;牛奶样品仅需6 h增菌能被检出,检测限为0.7 CFU/mL。联合使用免疫磁珠富集技术与选择性培养基,能在30 h内完成对牛奶样品的检测,较国标法减少38 h以上,且具有同等的灵敏度。     

原核表达MurA蛋白并制备其多克隆抗体用于免疫磁珠快速检测单增李斯特菌

【目的】制备MurA多抗,结合免疫磁珠与选择平板进行单增李斯特菌的快速检测,建立单增李斯特菌的免疫磁珠快速检测方法。【方法】构建MurA的原核表达载体,转化大肠杆菌进行优化表达。镍柱纯化表达产物,质谱鉴定重组蛋白,再免疫小鼠,制备其多克隆抗体。用所获多抗制备免疫磁珠,建立单增李斯特菌免疫磁珠-选择性培养基检测方法,并对人工污染牛奶样品进行检测。【结果】在大肠杆菌中高效表达了分子量约为72 kD的可溶性融合蛋白,质谱鉴定其为MurA蛋白;免疫小鼠获得的抗血清效价达1:10 000,与伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、大肠杆菌及属内其它病原菌均无交叉;所建立的免疫磁珠-选择性培养基检测法可检出浓度为103 CFU/mL及以上的单增李斯特菌,仅与英诺克李斯特菌存在一定交叉反应;牛奶样品单次仅需9 h增菌就能被检出,较常规增菌时间缩短39 h;检测限为0.4 CFU/mL。【结论】表达并纯化得到高纯度的单增李斯特菌MurA蛋白,制备的鼠源多克隆抗体亲和力高,特异性好;建立了快速检测单增李斯特菌的免疫磁珠联合选择性培养基法,在灵敏度不变的情况下,实现24 h内成功对牛奶样品的检测,较国标法减少42 h以上。     

苹果双变气调贮藏

苹果双变气调贮藏(TDCA)是在产地简易气调贮藏基础上,总结发展形成的一项新的理论与技术。与传统气调不同,TDCA贮藏初期采用较高温度(10℃或更高),高CO_2(10％以上),并在贮藏期间变动,由高到低。对比试验证明,TDCA贮藏效果优于冷藏,与气调相近。其生理机制在于显著抑制呼吸作用;抑制乙烯的生成和催熟作用,减弱叶绿素和原果胶分解;保持果实色泽和硬度,抑制虎皮病的发生。初步确定的双变模式在生产上应用获得良好效益。同时还讨论了贮藏期间温度和气体成分变动之间相互依赖的辨证关系以及环境因子变动的合理性。     

野桑蚕酚氧化酶原基因cDNA的分子克隆及其特征

酚氧化酶在昆虫的免疫防御机制中起着重要作用。利用RT-PCR和RACE方法,克隆了野桑蚕酚氧化酶原基因,获得了其cDNA序列。该序列长2 134 bp,含有一个2 082 bp的完整开放阅读框,编码一个由693个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO2基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的PPO基因所共有的典型特征。组织特异性表达分析表明了该基因在野桑蚕5龄幼虫的血细胞、体壁、头部、精巢、卵巢、脂肪体和中肠等组织及其不同的发育阶段均有表达。这些结果为进一步研究野桑蚕酚氧化酶原基因的功能提供了分子基础。