棉铃虫酚氧化酶原基因的克隆、序列分析和组织表达

利用RT-PCR和RACE方法,获得了棉铃虫Helicoverpa armigera酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)基因一个亚型cDNA的完整序列。该序列全长2 405 bp,含有一个2 097 bp的开放阅读框,编码一个由698个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO2基因相应氨基酸序列有较高的同源性(76％～80％),同时该序列具有铜离子结合位点等PPO基因所具有的典型特征。组织特异性表达分析表明,该基因在棉铃虫血细胞、体壁和中肠中均有表达。     

亚洲玉米螟幼虫酚氧化酶原基因序列的生物信息学分析

酚氧化酶原PPO是昆虫免疫的关键酶, 本文从生物信息学角度对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis Guenée幼虫PPO进行分析, 为进一步研究其高级结构与功能的关系提供理论依据。利用我们已提交到GenBank的数据, 采用在线分析及MEGA4和RasMol软件对亚洲玉米螟酚氧化酶原（Of-PPO）的核苷酸和氨基酸序列、系统发生关系和蛋白质三级结构进行分析。结果表明: Of-PPO全长cDNA序列有2 686 bp, 包含一个2 079 bp的开放阅读框, 其推导的693个氨基酸序列中包含6个组氨酸残基构成的2个铜离子结合位点, 以及保守的硫羟酸酯区域。Of-PPO属于PPO2类群, 其N端不含信号肽, 无跨膜结构域区域, 无糖基化位点, 44个磷酸化位点均匀分布于整个多肽链中, 有2段序列可能形成卷曲螺旋, 有5个区域的氨基酸具较强疏水性, 其二级结构中α-螺旋占22.54%, 随机卷曲占56.79%。同源建模显示其三级结构为“α/β型”中的“滚筒结构”, 存在一个明显的空位, 可能与该酶催化活性有关。本文可为Of-PPO的实验研究和应用开发提供有价值的信息。     

红螯螯虾酚氧化酶原及其特性研究

采用同源克隆策略和RACE技术, 从红螯螯虾Cherax quadricarinatus血细胞中克隆得到酚氧化酶原基因的全长cDNA序列, 共2951 bp, 开放读码框为1995 bp, 编码665个氨基酸. 预测的分子量和等电点分别为75.7 kD和6.23. 酚氧化酶原含有两个推测的tyrosinase copper-binding motifs (带有六个组氨酸残基)和一个thiol-ester-like motif, 这些特征和其他甲壳动物的酚氧化酶原特征相同. 红螯螯虾酚氧化酶原氨基酸序列与通讯螯虾Pacifastacus leniusculus、欧洲龙虾Homarus gammarus、美洲龙虾Homarus americanus 和克氏原螯虾Procambarus clarkii 酚氧化酶原的相似率分别为68%、63%、63%和59%. 酚氧化酶原基因双酶切后连接入pET-28a原核表达载体, 转化到大肠杆菌BL21后重组表达酚氧化酶原蛋白. 在重组蛋白纯化后, 免疫新西兰大耳兔制备得到的酚氧化酶原多克隆抗体, 其效价大于1:12800. 红螯螯虾血淋巴、肝和鳃组织中的酚氧化酶原mRNA表达和酚氧化酶活性较高, 而神经、心、肠和肌肉中较低. 中华绒螯蟹螺原体和嗜水气单胞菌免疫红螯螯虾后, 血淋巴细胞、肝和鳃组织中的酚氧化酶原和酚氧化酶活性在免疫后的不同时间均出现了显著性的增加, 此结果表明酚氧化酶原和酚氧化酶在红螯螯虾对抗细菌感染的过程中起到重要的免疫作用. 此结果为进一步深入研究酚氧化酶原基因和酚氧化酶的功能及其调控机理奠定基础.       

酚氧化酶参与德国小蠊对大肠杆菌的免疫应答

【目的】探讨酚氧化酶(phenoloxidase, PO)在德国小蠊Blattella germanica对大肠杆菌Escherichia coli的免疫响应中的作用。【方法】利用同源克隆和RACE方法获得德国小蠊酚氧化酶基因（BgPO）的全长cDNA序列,用MEGA5.1软件构建BgPO与其他昆虫PO的系统进化树,用RT-PCR方法检测BgPO的组织表达模式及大肠杆菌诱导后不同时间的表达量变化,用Hultmark 方法测定抑菌活力,用邻苯二酚法测定酚氧化酶活性。【结果】获得的德国小蠊BgPO基因（GenBank登录号：KJ789157）cDNA全长为2 252 bp,其中开放阅读框大小为2 085 bp,编码695个氨基酸,预测的分子量和等电点分别为79.7 kDa和6.19。Blast分析结果表明德国小蠊BgPO与其他昆虫PO有较高的同源性,其中与白蚁Coptotermes formosanus PO的氨基酸序列一致性高达80%;系统进化树分析显示其与C. formosanus PO的亲缘关系最近。基因表达检测结果表明BgPO主要在血淋巴细胞和表皮中表达。大肠杆菌诱导德国小蠊后,发现BgPO的表达量在诱导24 h后升高,在诱导后36 h达到峰值;其血淋巴的抑菌活力及酚氧化酶的活性在诱导后6-36 h内均随着诱导时间的增加而增加,且菌诱导组与PBS诱导组之间存在显著差异(P<0.05)。【结论】本研究获得的德国小蠊酚氧化酶基因BgPO主要在血淋巴和表皮中表达,并参与了大肠杆菌诱导的免疫应答反应。研究结果为进一步探索酚氧化酶在德国小蠊对病原菌的免疫响应机制奠定基础。     

野桑蚕卵黄原蛋白的鉴定及cDNA序列分析

利用SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定了野桑蚕Bombyx mandarina Moore卵黄原蛋白,发现该蛋白由大小两个亚基组成,分子量分别为175 kD和42 kD。利用昆虫卵黄原蛋白进化上的保守性,根据家蚕的卵黄原蛋白cDNA序列设计特异性引物在野桑蚕的总RNA进行RT-PCR扩增,对于3′和5′端进行RACE扩增,解析获得了野桑蚕卵黄原蛋白cDNA全序列(GenBank登录号AY 309967)。该序列含有5.754个碱基,由一个开放阅读框组成,编码1.780个氨基酸,卵黄原蛋白的氨基酸序列与家蚕的同源性达到97.6%。在特定的酶切位点(RSRR)处,即第364～367个氨基酸位置,卵黄原蛋白前体被酶切为大小两个亚基,根据氨基酸推算的相对分子质量分别为161.571 kD和40.794 kD,如果考虑到翻译后的修饰,这与SDS-PAGE的结果是吻合的。同源性分析表明,昆虫卵黄原蛋白一级结构分化基本上局限在同一目内,具有较高的保守性。     

青杨脊虎天牛CYP4G2基因片段的克隆、序列分析与表达

根据报道的十几种昆虫CYP4家族基因的氨基酸序列保守区域设计一对引物,利用RT-PCR技术扩增编码青杨脊虎天牛Xylotechus rusticus中肠细胞色素氧化酶CYP4G2蛋白的cDNA片段,构建原核表达载体pET-CYP4G2,将其转化入大肠杆菌Escherichia coli JM109中表达。序列分析结果表明,该基因(CYP4G2,GenBank登录号为EF429250)保守区域阅读框全长387 bp,编码129个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为16.9 kD和5.75;推导的氨基酸序列与已报道的昆虫CYP4家族氨基酸序列一致性较高（63%～86%）,且具有细胞色素氧化酶的典型特征。IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳检测到一条22 kD大小的外源蛋白,与预测融合蛋白的分子量大小相应。CO差光谱分析证明重组菌表达了有活性的pET-CYP4G2。     

昆虫酚氧化酶原活化及其在免疫中的作用

1　前言酚氧化酶 (phenoloxidase,PO)以无活性的酶原形式——酚氧化酶原 (prophenoloxi-dase,PPO)存在于昆虫血淋巴、中肠和表皮等组织 ,当病原生物入侵时 ,通过特异性丝氨酸蛋白酶的级联反应 (PPO级联 )被活化 ,参与机体的免疫防御反应 [1] 。本文拟就近年来有关昆虫PPO级联及其在免疫中的作用等研究方面的新进展做一简述。2　PPO的特性及其分子生物学PPO是 PPO级联中一个很重要的成分 ,近年来 ,随着分子生物学技术和其他相关学科的快速发展及向昆虫学领域的日渐渗透 ,有关PPO特性及其分子生物学方面的研究取得了很大进展。目前…     

棉铃虫漆酶2基因的分子鉴定

【目的】黑化反应在昆虫表皮骨化以及免疫防御过程中起着重要作用, 酚氧化酶是黑化反应中的关键酶类, 漆酶2 (laccase2, LAC2)是酚氧化酶的一种, 在昆虫变态发育和免疫系统中起着重要的作用。本研究旨在探讨LAC2在棉铃虫Helicoverpa armigera表皮骨化中表达模式及激素调控作用。 【方法】采用PCR及RACE的方法, 从棉铃虫5龄幼虫中得到了lac2 cDNA全序列。利用荧光定量PCR、 激素处理及RNA干扰方法, 对LAC2的表达模式差异和激素调控作用进行分析。【结果】序列分析表明, lac2 cDNA全长3 221 bp, 编码框长度为2 268 bp, 编码756个氨基酸残基。发育时序表达分析发现, lac2在幼虫各龄期表达规律相似, 均在蜕皮期高水平表达, 在5龄96 h转录水平达到最高峰。组织表达结果分析, lac2基因在幼虫表皮和成虫卵巢以及触角表达量较高。激素处理实验发现, 保幼激素类似物（methoprene）对lac2基因转录有抑制作用; 蜕皮激素（20-hydroxyecdysone）则促进其表达。进一步利用RNA干扰蜕皮激素受体EcR （ecdysone receptor）和USP （ultraspiracle isoform）基因发现, 干扰后蜕皮激素受体的表达明显受到抑制, 同时lac2基因的表达也显著受到抑制, 表明蜕皮激素调控lac2基因转录。【结论】这些结果为进一步研究漆酶在昆虫表皮的骨化以及免疫防御等方面不同的生理功能提供理论依据。     

两种色型黄粉虫酚氧化酶原的cDNA克隆、生物信息学分析及表达水平检测

酚氧化酶是黑色素合成和昆虫免疫的关键酶, 通常以无活性的酚氧化酶原形式存在。为给黄粉虫Tenebrio molitor遗传分化和免疫防御研究提供参考, 本研究采用PCR和RACE技术克隆了黄、 黑两种色型黄粉虫幼虫的酚氧化酶原基因Tm-ppo, 对其cDNA序列及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析, 采用实时荧光定量PCR检测其在两种色型黄粉虫不同发育阶段mRNA表达水平上的动态变化。结果表明： 从黄、 黑两种色型黄粉虫幼虫中克隆出的两个Tm-ppo cDNA序列全长均为2 199 bp, 碱基序列一致性为99%, 包含一个2 055 bp的开放阅读框, 编码684个氨基酸, 它们的编码蛋白有3个氨基酸差异： 第176位（P→A）、 256位（V→A）和648位（I→M）。这两个基因分别被命名为Tm-ppo-1和Tm-ppo-2 （GenBank登录号分别为JX987235和JX987234）。 Tm-ppo-1和Tm-ppo-2编码的酚氧化酶原异构体蛋白（分别为Tm-PPO-1和Tm-PPO-2）存在一个可能的酚氧化酶原水解活化位点（R50~F51残基之间）和一个双铜结合中心（第196~239位残基和第344~411位残基）; 同时含有一个类似巯基酯区域的序列（第579~588位残基）及一个C 末端保守基序（第634~645位残基）; 但它们无氨基端疏水信号肽序列, 也不存在跨膜区域。Tm-PPO-1和Tm-PPO-2的二级结构由大量的α 螺旋、 β-折叠和无规则卷曲组成; 三级结构分为前导域（第16~66位残基）、 不相邻的功能域Ⅰ（第3~15位残基和第67~181位残基）、 功能域Ⅱ（第182~419位残基）和功能域Ⅲ（第420~679位残基）4部分。此外, Tm-ppo-1和Tm-ppo-2在黄、 黑两种色型黄粉虫的各发育期均有表达, 并且不同发育阶段的mRNA表达水平呈现明显的变化规律： 幼虫期﹥成虫期﹥蛹期。同时, 环境温度对Tm-ppo-1和Tm-ppo-2的mRNA表达具有显著影响： 与常温对照组（25~30℃）相比, 42℃暴露24 h和48 h的两种色型黄粉虫幼虫、 蛹和成虫的mRNA表达量明显下调。相同试验条件下, 黑色型黄粉虫幼虫和成虫的Tm-ppo-2 mRNA表达量明显高于黄色型幼虫和成虫的Tm-ppo-1 mRNA表达量, 但两种色型黄粉虫蛹的Tm-ppo异构体表达量无显著差异。本研究为进一步探讨黄粉虫的遗传分化和免疫防御提供了有益参考。     

棉铃虫HaKettin1基因的全长cDNA克隆、序列分析和表达谱

【目的】为了克隆棉铃虫Helicoverpa armigera编码肌肉蛋白Kettin基因的全长cDNA序列以及鉴定该基因在棉铃虫发育周期内的表达模式。【方法】利用兼并引物,通过分段RT-PCR和5′-和3′-RACE的方法克隆全长cDNA序列。利用半定量RT-PCR进行表达谱分析。【结果】编码棉铃虫Kettin蛋白的基因HaKettin1全长cDNA序列为13 805 bp,包含一个13 365 bp的开放阅读框,编码4 454个氨基酸,蛋白分子量约为504.3 kD。组织表达结果显示HaKettin1基因在棉铃虫的整个生育周期都有表达,幼虫期的表达尤为显著。【结论】HaKettin1与家蚕的Kettin蛋白具有90％的同源性,表明鳞翅目昆虫的Kettin蛋白之间具有很高的保守性。表达谱结果显示HaKettin1基因在棉铃虫的整个发育过程中都发挥重要作用。     

意大利蜜蜂甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因amGAPDH2的cDNA克隆与序列分析

应用RT-PCR技术克隆了意大利蜜蜂(Apis mellifera)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因amGAPDH2,利用MEGA5.1、DNAMAN、PredictProtein和I-TASSER等软件对该基因进化关系以及其所对应的蛋白的同源性、理化性质和结构进行了预测和分析。从意大利蜜蜂cDNA文库中克隆得到了长1188 bp的amGAPDH2序列,GenBank登录号为MH152402。该序列具有完整的开放阅读框(ORF,114~1115 bp),其编码333个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列与其它昆虫的GAPDH有较高的序列相似性(80%以上),系统进化分析表明amGAPDH2与中华蜜蜂、小蜜蜂的序列相似性最高。利用ProtParam等软件对amGAPDH2编码的蛋白质分析结果显示,amGAPDH2属于不稳定、亲水性蛋白;二级结构属于混合型,Helix占25.53%、Strand占24.62%、Loop占49.85%;am GAPDH2具有两个保守结构域:一个是N端的NAD(P)结合结构域,另一个是C端的催化结构域Gp_dh_C。该研究为后期amGAPDH2基因的生理功能研究提供了理论依据。     

草鱼瘦素受体基因片段序列的克隆及其组织表达分析

根据斑马鱼、大西洋鲑和人等物种巴知的瘦素受体基因核苷酸保守区序列设计一对简并引物,通过RT-PCR法从草鱼肝胰脏中首次克隆获得草鱼瘦素受体基因的片段序列.该片段序列长713 bp,编码237个氨基酸,氨基酸序列分析表明草鱼瘦素受体基因片段氨基酸序列与其他物种的相似性在35％ -86％之间.通过邻接法(Neighbor Joining,NJ)构建系统进化树显示,鱼类的瘦素受体独立聚成一支,草鱼与金鱼、斑马鱼聚成一支,再与日本青鳉、黑点青鳉、红鳍东方鲀和大西洋鲑聚成一支.通过实时荧光定量PCR分析草鱼瘦素受体基因的组织差异表达,结果表明,草鱼瘦素受体基因在肝胰脏、肌肉、脑、心脏、脾和肠系膜脂肪组织中均有表达,其中在脾脏组织中表达量最多,显著高于其他组织(P＜0.05),其次是心脏、脑、肌肉和肠系膜脂肪组织,在肝胰脏组织中表达量最低,且显著低于其他组织(P＜0.05).     

烟夜蛾几丁质酶基因的克隆与表达

运用RT-PCR技术扩增编码烟夜蛾Helicoverpaassulta(Guen啨e)幼虫几丁质酶基因的cDNA片段,将其克隆至pMD18-T载体,获得该基因的成熟蛋白阅读框序列。将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T-2中,并转化入原核细胞中表达,序列测定结果表明,烟夜蛾幼虫几丁质酶基因的成熟蛋白阅读框全长1338bp,编码445个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为50.1kDa和9.26;推导的氨基酸序列与其近缘种棉铃虫几丁质酶氨基酸序列的一致性达99%,与其他6种昆虫几丁质酶的氨基酸序列也高度一致(65%~76%),并具有几丁质酶的典型特征。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上并转化BL21,SDS-PAGE和Western印迹分析表明,经IPTG诱导,76kDa附近没有特异蛋白条带出现,表明烟夜蛾几丁质酶基因不能在原核表达载体pGEX-4T-2中表达。     

Tissue-/stage-dependent expression of a cloned Bombyx mandarina QM homologue

QM, a novel gene that was firstly isolated as a putative tumor suppressor gene from Wilms' tumor cell line. Although it is well known that the QM gene product plays an important role within the tumor cells, the precise role of QM in the non-tumor cells has remained elusive. With in this mind we isolated a cDNA encoding QM homologue from Bombyx mandarina to understand the function of QM. The 596 bp cDNA has an open reading frame of 219 amino acids and a predicted mol. wt. of 25 kDa. The protein has more than 88% amino acid sequence identity to the QM protein from Drosophila melanogaster. mRNA expression gradually increased from 1-2 days after egg laying to 2 days of finial instar, while very low expressions were detected for either the pupae and the moth stages. The organs, posterior/middle division of silkgland, midgut, fat body and malpighian tubes, also show relatively high mRNA expression levels, respectively. The high degree of conservation and expression of the B. mandarina QM homologous suggest that it has a selectively conserved amino acid sequence due, presumably, to an important biological role which is associated with pupae formation.     

家蚕P450基因CYP18A1的克隆、序列分析及转录活性

蜕皮激素对昆虫生长、发育和繁殖有重要调控作用,尤其对蜕皮和变态过程。利用GenBank上登录的蜕皮激素C₂₆羟基化酶候选基因CYP18A1的氨基酸序列对家蚕Bombyx mori全基因组数据库进行BLASTP比对,发现了家蚕直向同源基因(ortholog),其完全编码序列经RT-PCR检测和克隆、测序验证后,再以此为信息探针检索家蚕表达序列标签(expressed sequence tags,EST)数据库进行拼接延伸,获得了一条包括5′非翻译区在内的长度为1 737 bp的cDNA序列,验证结果也表明与电子克隆序列完全一致(GenBank登录号为EF421988,P450命名委员会将其命名为CYP18A1)。该基因的开放阅读框为1 623 bp,编码541个氨基酸,含有包括P450s特征结构域在内的所有昆虫P450基因的5个保守结构域,其推定的分子量为61.67 kD,等电点为 8.54。将该基因cDNA序列与家蚕基因组序列进行比对,结果表明该基因具有6个外显子,5个内含子,外显子／内含子边界符合经典的GT-AG规则。同源性分析也发现家蚕CYP18A1与其他昆虫的直向同源基因具有较高相似性。用RT-PCR方法对家蚕主要发育变态时期与组织进行检测,显示出该基因的转录表达不仅具有时空特异性,而且在表达时期上与已报道的蚕体内蜕皮激素含量变化有紧密的一致性。该研究进一步证实了CYP18A1基因与昆虫体内蜕皮激素代谢平衡相关联。     

Oxidase gene from sweetpotato

Polyphenol oxidase is the enzyme responsible for enzymatic browning in sweetpotato that decreases the commercial value of sweetpotato products. Here we reported the cloning and characterization of a new cDNA encoding PPO from sweetpotato, designated as IbPPO (GeneBank accession number: AY822711). The full-length cDNA of IbPPO is 1984 bp with a 1767 bp open reading frame (ORF) encoding a 588 amino acid polypeptide with calculated molecular weight of 65.7 kDa and theoretical pI of 6.28. The coding sequence of IbPPO was also directly amplified from the genomic DNA of sweetpotato that demonstrated that IbPPO was an intron-free gene. The computational comparative analysis revealed that IbPPO showed homology to other PPOs of plant origin and contained a 50 amino acid plastidial transit peptides at its N-terminal and the two conserved CuA and CuB copper-binding motifs in the catalytic region of IbPPO. A highly conserved serine-rich motif was firstly found in the transit peptides of plant PPO enzymes. Then the homology-based structural modeling of IbPPO showed that IbPPO had the typical structure of PPO: the catalytic copper center was accommodated in a central four-helix bundle located in a hydrophobic pocket close to the surface. Finally, the results of the semi-quantitative RT-PCR analysis of IbPPO in different tissues demonstrated that IbPPO could express in all the organs of sweetpotato including: mature leaves, young leaves, the stems of mature leaves (petioles), the storage roots and the veins but at different levels. The highest-level expression of IbPPO was found in veins, followed by storage roots, young leaves and mature leaves; and the lowest-level expression of IbPPO was found in petioles. The present researches will facilitate the development of anti-brown sweetpotato by genetic engineering.