小鼠睾丸注射不同转染试剂和注射方法对外源基因表达的影响

为探讨不同转染试剂(LipofectamineTM LTXPLUSTM、Lipofectamine2000和纳米化聚酰胺-胺型树枝状聚合物(PAMAM-D))和睾丸注射方法 (睾丸网注射、曲精细管注射和间质注射)对转基因小鼠生产效率的影响,将pEGFP-C1质粒分别与不同转染试剂混合后,按照不同的注射方法注入小鼠睾丸内,30 d后检测小鼠精子密度、活力、精子阳性率以及配种后仔鼠转基因阳性率。结果 3种转染试剂对小鼠繁殖性能影响由小到大依次为LipofectamineTM LTXPLUSTM、Lipofectamine 2000和PAMAM-D。转染后LipofectamineTM LTXPLUSTM、Lipofectamine 2000和PAMAM-D组精子的GFP阳性率分别为35.65%±0.69%、12.86%±0.35%和10.04%±0.20%。配种后仔鼠的PCR阳性率分别为29.17%、13.70%和5.88%。3种不同注射方法对小鼠睾丸都造成损伤,由小到大依次为睾丸网注射、曲精细管注射和睾丸间质注射,三者的阳性精子比例分别为35.13%±1.727%、15.13%±1.457%和0%,配种后仔鼠的PCR阳性率分别为33.3%、12.5%和0%。结果表明,LipofectamineTM LTXPLUSTM和睾丸网注射对小鼠睾丸的损伤最小,并能获得较高的转染效率。     

Spindle-view系统在猪卵母细胞去核中的应用

应用Spindle-view对体外成熟培养36、42、44和48h的猪体外成熟卵母细胞减数分裂纺锤体进行去核操作,并与传统去核方法(McGrath-Solter去核法,挤压去核法)相比较,结果表明:①在42~48h之间利用Spindle-view得到的猪卵纺锤体影像与极体的相对位置没有明显的变化;②Spindle-view适合用于猪体外成熟卵母细胞减数分裂纺锤体的观察及去核;去核效率与其他两种方法相比差异极显著(95.5%,42.1%,74.2%,P<0.01);③纺锤体成像是否清晰可用于猪卵母细胞的质量监控。     

微流控芯片用于卵母细胞冷冻保存的实验研究

低温保存对卵母细胞造成渗透损伤、毒性损伤和冰晶损伤,使得细胞冻后质量难以提高.本文首次提出将微流控法添加-去除保护剂分别与三种冷冻载体(OPS、QC及Cryotop)搭配使用,对猪卵母细胞进行冷冻保存,并与传统冷冻法进行比较;然后,首次选用透明陶瓷和玻璃制作集成一体化芯片,对猪卵母细胞进行冷冻保存,以冷冻保存后的细胞存活率和发育率为判断依据,筛选出较好的方案;最后,对冻后卵母细胞的早期凋亡情况、胞内活性氧水平和线粒体膜电位水平进行分析.结果表明,微流控添加-去除保护剂组卵母细胞冻后存活率以及卵裂率都显著高于传统冷冻组,可以有效降低卵母细胞的早期凋亡率和胞内活性氧水平,减小线粒体损伤,提高细胞的冻后质量.透明陶瓷一体化芯片保存卵母细胞得到的存活率和卵裂率与传统OPS冷冻的保存结果无显著差异.微流控芯片技术为卵母细胞的低温保存提供新的思路,有较好的应用前景.     

应用生物技术保存地方猪种种质资源研究

我国地方猪种资源十分丰富,拥有许多突出特性的品种,受到国内外养猪业者的重视。由于种种原因,有些猪种濒临绝种。生物技术的发展给地方猪种种质资源长期保存带来了希望。结合课题组近年来来的相关工作,概述了我国地方猪种资源概况及保种的迫切性,冷冻保种研究现状及地方猪种种质资源长期保存的主要技术,包括猪种配子和胚胎冷冻技术、基因组DNA库、猪体细胞克隆技术及其在长期保存种的作用。     

微流控线性加载低温保护剂减少猪MⅡ期卵母细胞的渗透损伤

在卵母细胞低温保存中,通常需要加载冷冻保护剂来抑制冰晶对细胞的损伤,但高浓度冷冻保护剂的加载会对细胞造成渗透损伤.为了减小细胞的渗透损伤,本文设计并制作了适合卵母细胞冷冻保护剂加载的微流体装置,研究了微流控线性加载30%(v/v)二甲基亚砜(Me2SO)低温保护剂时细胞内保护剂浓度变化、细胞体积变化,以及对细胞存活率与发育率的影响,并与传统的加载方法(一步法、分步法)做了比较.结果表明:微流控法能够实现卵母细胞冷冻保护剂的连续线性加载,避免了卵母细胞体积的骤变,显著减小了细胞的渗透损伤,提高了细胞的存活率.其中细胞的最小渗透体积减小为0.86V0,细胞的存活率达到92.8%,比一步法高33%,比两步法高16.3%,但与四步法之间无显著性差异.经孤雌激活后体外培养,细胞的卵裂率和囊胚率分别达到75.8%和27.4%,都显著高于一步法和分步法(P0.05).因此,微流控线性加载低温保护剂能够显著减小细胞的渗透损伤,为卵母细胞低温保存技术提供新思路.     

支气管哮喘遗传因子研究

研究谷胱甘肽-S-转移酶 （glutathione S-transferase, GST）M1和T1基因多态性与支气管哮喘（asthma bronchial）的关系。采取聚合酶链反应对60名支气管哮喘患者和60名正常对照进行了GSTM1和GSTT1基因非缺失（+）和缺失（0）等位基因分布频率研究。结果表明,与对照组相比,支气管哮喘患者GSTM1基因缺失的纯合子（0/0）频率（81.2%）显著升高（χ2=32.46,P<0.001;wχ2=28.75,P<0.001）。对于GSTT1也得到类似资料。而支气管哮喘患者GSTT1基因缺失等位基因（0/0）频率（71.7%）比对照组（11.7%）显著升高（χ2=26.72,P<0.001;wχ2=35.75,P<0.001）。表明GSTM1、GSTT1缺失等位基因纯合性在哮喘患者中最有特征性的。GSTM1 0/0、GSTT1 0/0结合的频率患者组为61.7%,对照组仅为1.7%（χ2=27.3,P<0.001）。提示GSTM1和GSTT1基因多态性与哮喘有显著性关联,两个基因的突变可以被视为发生支气管哮喘遗传风险因子。     

微流控芯片加载低温保护剂过程中卵母细胞的损伤评估

卵母细胞的低温保存为辅助生殖技术和胚胎工程技术提供了更大的发展空间,而低温保存需要添加高浓度保护剂,会对细胞造成渗透损伤及毒性损伤.与分步法添加固定浓度的保护剂不同,微流控法能够实现保护剂浓度的连续性变化,关于微流控法连续性添加保护剂时卵母细胞的损伤评估还未见报道.本文首先采用数值模拟的方法,模拟细胞在不同加载时间、不同加载线型(线性、S型、凹型)、不同凹型加载(低凹型、高凹型)中细胞的渗透行为,计算各方案中细胞的传统的损伤评估参数:体积变化极值(ΔV)、积累性渗透损伤值(AOD)及毒性损伤值(J).在此基础上,藉由信息熵理论首次提出了综合损伤评估参数s,并通过猪卵母细胞微流控加载后孤雌激活实验的结果验证评估效果.结果表明,对于不同的加载方案,传统的损伤评估参数结果之间出现分歧,无法得到统一的结论.通过分析囊胚率同综合损伤评估参数s值的关系,发现二者呈负相关关系,且相关系数很高,说明综合损伤评估参数s能够较好地对细胞损伤进行评估,为细胞损伤评估开辟了新思路.     

海藻糖对猪精子冷冻真空干燥保存效果的影响

猪精子经冷冻干燥后,在光学显微镜和电子显微镜下观察其超微结构,并借助辅助生殖技术将其注入猪卵母细胞后,进一步观察受精卵的发育情况。结果表明：海藻糖组雄原核形成率 (68.52％)、卵裂率 (59.17％) 和囊胚率 (19.16％) 优于EDTA组 (64.59％、56.26％和15.62％) 和对照组 (35.36％、52.33％和8.60％) (P＜0.05);海藻糖组的冷冻真空干燥猪精子分别在4℃下保存60、120、180 d,雄原核形成率、卵裂率和囊胚率均无显著差异 (P＞0.05);海藻糖组的冷冻真空干燥猪精子复水化后孵育1 h和2 h,卵裂率、卵裂率和囊胚率均差异显著 (P＜0.05);海藻糖处理组与EDTA处理组中的冷冻真空干燥猪精子分别在4℃和?20℃下保存后各处理组间精子形态差异不显著 (P＞0.05);海藻糖组中B级冷冻真空干燥精子百分数显著多于EDTA处理组 (P＜0.05)。超微结构分析表明,冷冻真空干燥猪精子的损伤主要表现在顶体和颈部的肿胀与缺损、尾部断裂。     

猪卵母细胞玻璃化冷冻后细胞骨架的变化

为研究玻璃化冷冻后猪卵母细胞纺锤体、染色体和微丝的变化,从屠宰猪卵巢表面直径2—5mm卵泡中采集未成熟(GV)期卵母细胞,由GV期卵母细胞经成熟培养获得体外成熟(MⅡ)期卵母细胞。GV期和MⅡ期卵母细胞各分为3组对照组、冷冻保护剂处理组和玻璃化冷冻组。MⅡ期卵母细胞经分组处理后直接用于激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察样本;而GV期卵母细胞处理后先经44h成熟培养,再用作LSCM观察样本。供试卵母细胞经固定、免疫荧光染色后,于LSCM下观察。结果表明,冷冻保护剂处理组GV期卵母细胞经成熟培养后,其纺锤体结构、染色体排列与微丝分布正常率分别为42.9%、89.6%和28.6%;玻璃化冷冻组此3项指标的正常率分别为10.1%、36.4%和16.9%,两组间差异显著(P<0.05);除冷冻保护剂处理组染色体正常率与对照组无较大差异外,两试验组的其他指标均明显低于对照组(分别为79.5%、93.1%和72.3%,P<0.05)。MⅡ期卵母细胞冷冻保护剂处理组的纺锤体结构、染色体排列与微丝分布正常率分别为34.4%、61.3%和47.9%,而冷冻组分别为12.9%、56.7%和37.2%,两组均显著低于对照组(分别为78.3%、90.1%和72.8%,P<0.05)。结果表明,猪GV期和MⅡ期卵母细胞经冷冻保护剂处理或玻璃化冷冻保存后,均造成了纺锤体、染色体和微丝不可逆的损伤,这可能是影响卵母细胞成熟、受精与发育的重要原因。     

猪卵母细胞玻璃化冷冻后细胞骨架的变化

为研究玻璃化冷冻后猪卵母细胞纺锤体、染色体和微丝的变化，从屠宰猪卵巢表面直径2—5 mm卵泡中采集未成熟(GV)期卵母细胞，由GV期卵母细胞经成熟培养获得体外成熟(MⅡ)期卵母细胞。GV期和MⅡ期卵母细胞各分为3组：对照组、冷冻保护剂处理组和玻璃化冷冻组。MⅡ期卵母细胞经分组处理后直接用于激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察样本；而GV期卵母细胞处理后先经44 h成熟培养，再用作LSCM观察样本。供试卵母细胞经固定、免疫荧光染色后，于LSCM下观察。结果表明，冷冻保护剂处理组GV期卵母细胞经成熟培养后，其纺锤体结构、染色体排列与微丝分布正常率分别为42.9%、89.6%和28.6%；玻璃化冷冻组此3项指标的正常率分别为10.1%、36.4%和16.9%，两组间差异显著(P<0.05)；除冷冻保护剂处理组染色体正常率与对照组无较大差异外，两试验组的其他指标均明显低于对照组(分别为79.5%、93.1%和72.3%，P<0.05)。MⅡ期卵母细胞冷冻保护剂处理组的纺锤体结构、染色体排列与微丝分布正常率分别为34.4%、61.3%和47.9%，而冷冻组分别为12.9%、56.7%和37.2%，两组均显著低于对照组(分别为78.3%、90.1%和72.8%，P<0.05)。结果表明，猪GV期和MⅡ期卵母细胞经冷冻保护剂处理或玻璃化冷冻保存后，均造成了纺锤体、染色体和微丝不可逆的损伤，这可能是影响卵母细胞成熟、受精与发育的重要原因。