TaqMan-MGB探针检测文森巴尔通体博格霍夫亚种实时荧光定量PCR方法的建立及应用

【目的】应用TaqMan-MGB探针技术,建立具有种水平特异性、高敏感性的荧光定量PCR方法,用于快速检测文森巴尔通体博格霍夫亚种。【方法】在序列特异性扩增区标记(Sequence characterized amplifiedregion,SCAR)技术基础上,依据文森巴尔通体博格霍夫亚种一段特有的基因序列设计探针和引物,分别优化扩增反应的退火温度、探针和引物的反应浓度;分析此方法的特异性、敏感性及重复性;绘制标准曲线,评估PCR反应的扩增效率和稳定性。【结果】本研究设计的TaqMan-MGB探针具有种水平特异性;最低检出限为每个PCR反应11个拷贝;组内和组间的变异系数CV值分别为0.12%-0.70%和0.14%-0.55%,在允许范围内;标准曲线线性关系良好(R2=1),扩增效率高(E=104.7%)。【结论】本研究建立的基于TaqMan-MGB探针技术的荧光定量PCR方法能够在种水平特异性、高灵敏度检出文森巴尔通体博格霍夫亚种,为这种巴尔通体所引起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。     

外源木聚糖酶在枯草芽胞杆菌中信号肽筛选

[目的]本试验旨在筛选引导表达外源木聚糖酶基因高效分泌的信号肽,为枯草芽胞杆菌木聚糖酶高效分泌表达系统提供元件.[方法]构建信号肽筛选载体,载体是以含壮观霉素抗性基因的大肠-枯草穿梭载体为基本骨架,目标蛋白为耐碱性木聚糖酶,可在麦芽糖启动子Pglv诱导下表达.从枯草芽胞杆菌A1747基因组中扩增获得24个Sec途径信号肽,并将其全部链接到至筛选载体上,并在枯草芽胞杆菌WB700中实现表达分泌.重组菌在3%麦芽糖诱导下培养24h后用DNS法测定上清酶活.[结果]成功构建信号肽筛选载体pGPSX及24个表达载体,实现木聚糖酶表达分泌.且不同信号肽对于引导外源木聚糖酶分泌能力不同,其中YnfF信号肽引导分泌目标蛋白效率最高,上清酶活为37.2IU/mL.[结论]试验证明在枯草杆菌中对外源蛋白进行信号肽筛选是提高其分泌的有效途径,并获得了针对木聚糖酶高效分泌信号肽YnfF.     

巴尔通体在滇西南蝙蝠中高度流行并具有丰富的遗传变异特征

蝙蝠是很多病原微生物的自然宿主, 全球多项研究表明蝙蝠是巴尔通体(Bartonella species)的主要宿主。为了解滇西南地区蝙蝠中巴尔通体的流行特征, 我们于2015-2017年间在云南省4个地区应用网捕法捕获蝙蝠3种305只。经种类鉴定后采集肝脾组织, 提取核酸, 通过TaqMan实时荧光定量PCR方法检测巴尔通体的tmRNA基因ssrA, 并进行测序鉴定和系统发育分析。结果发现172只蝙蝠检出该基因, 总感染率为56.4%; 其中临沧、西双版纳、保山和瑞丽4个采样点的蝙蝠感染率分别为50.0% (22/44)、61.7% (29/47)、62.1% (18/29)和55.7% (103/185)。中菊头蝠(Rhinolophus affinis)、小菊头蝠(R. blythi)和棕果蝠(Rousettus leschenaultii)的感染率分别为50.0% (22/44)、62.1% (18/29)和56.9% (132/232), 差异没有统计学意义(χ² = 1.135, P = 0.567), 表明巴尔通体在云南当地的蝙蝠种群中高度流行。定量PCR扩增产物2次扩增后测序获得37个巴尔通体ssrA序列, 属于10个系统发育分支, 其中1个为伊丽莎白巴尔通体(B. elizabethae)、特利波契巴尔通体(B. tribocorum)和克拉斯诺夫巴尔通体(B. krasnovii)的近缘种。其余序列与已知巴尔通体距离较远, 与亚洲、欧洲和美洲等其他地域来源于蝙蝠的巴尔通体近缘。遗传多样性分析显示, ssrA基因的核苷酸多样性指数(π)为0.11381 ± 0.00928, 基因型多样性指数(Hd)为0.985 ± 0.010, 形成29个基因型(单倍型), 说明云南蝙蝠巴尔通体具有丰富的遗传多样性。通过对本研究标本与全球相关序列的系统发育网络重建, 分析全球蝙蝠巴尔通体的地理和宿主分布特征, 可以看出巴尔通体与蝙蝠之间存在显著的宿主特异性关联。因此可初步确定蝙蝠-巴尔通体具有协同进化特征, 同时受到地理隔离的影响。     

中国家猫克氏巴尔通体分离株生物学及分子特征分析

摘要：【目的】分析中国家猫中分离的巴尔通体菌株M9HN-SHQ生物学性状和分子特征。【方法】应用含5％羊血的胰酶大豆琼脂培养基在5％ CO2培养箱中37℃培养6～7 d,革兰氏和吉姆尼茨染色镜下观察形态;应用VITEK ANI厌氧菌鉴定卡进行生化反应鉴定;气相色谱分析方法获取菌体脂肪酸成份组成（CFA）;Etest药敏试条测定对10种抗生素的敏感性;分别应用随机扩增多态性DNA（RAPD）和脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术对目标菌株和其他国际标准菌株等绘制DNA指纹图谱;对16S rRNA,gltA,gro     

巴尔通体细胞脂肪酸成分分析

【目的】分析影响巴尔通体脂肪酸成分的主要因素,建立适合巴尔通体脂肪酸成分分析的标准化方法,探讨脂肪酸图谱应用于巴尔通体分类鉴定的可能性。【方法】应用气相色谱技术分析不同培养条件下巴尔通体脂肪酸的组成与含量的变化;应用已构建的标准化方法获取10株巴尔通体标准菌株和9株来自不同地区的汉赛巴尔通体猫分离株脂肪酸图谱;应用SPSS16.0统计软件对获得的数据资料进行聚类分析。【结果】培养基、温度和传代次数主要影响巴尔通体脂肪酸的微量成分;10株巴尔通体标准菌株的成分相似,但也存在构成和含量上的差异;在所测巴尔通体中,检出可分辨脂肪酸成分有20种,共有成分为7种,其中C18:1ω7c、C18:0和C16:0累积含量达80%以上;猫分离株被准确鉴定为汉赛巴尔通体。【结论】巴尔通体脂肪酸成分受培养基、温度等培养条件影响,在脂肪酸提取方法标化后,可用于汉赛巴尔通体种水平分类鉴定。     

实时荧光定量TaqMan-MGB探针法检测杆菌样巴尔通体

【目的】应用Taq Man探针实时荧光定量PCR技术建立特异性强、敏感性高和稳定性好的快速杆菌样巴尔通体检测方法。【方法】应用生物信息学方法查找杆菌样巴尔通体特有基因,从中筛选出一段特有的基因序列为模板设计探针和引物。通过比较Ct值和荧光强度确定扩增反应的最佳退火温度、探针和引物浓度;将扩增产物连接到p EASY-T载体上制备标准品,绘制标准曲线,分析扩增效率和线性关系;评估方法的特异性、敏感性及重复性。【结果】优化后退火温度为60°C,探针和引物浓度均为200 nmol/L,反应体系20μL。特异性实验显示只有杆菌样巴尔通体扩增出荧光信号,其他种属细菌均未见荧光信号;标准曲线线性关系良好(R2=1),扩增效率E=98.18%;最低检出限为每个PCR反应3个拷贝;组内和组间的变异系数CV值分别为0.21%–0.42%和0.29%–0.59%,在允许范围内。【结论】研究建立的实时荧光定量Taq Man-MGB探针法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可快速检测鉴定杆菌样巴尔通体,为这种巴尔通体所引起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。     

中国部分地区实验猕猴巴尔通体感染状况及其遗传特征

【目的】五日热巴尔通体(Bartonella quintana)由体虱在人群中传播,可引起多种人类疾病包括战壕热。为进一步搜集猕猴是五日热巴尔通体自然宿主的证据,本研究调查了国内4个地区实验用猕猴五日热巴尔通体的感染状况,对菌株遗传特征进行了分析。【方法】采集猕猴全血和血清样品各550份,用于菌株分离、核酸和血清IgG抗体检测。应用6个管家基因扩增及测序方法进行菌株鉴定、系统发育及核苷酸多态性分析;应用随机扩增多态性DNA标记(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术分析不同宿主来源菌株RAPD指纹图谱差异;应用间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)检测血清中抗五日热巴尔通体IgG抗体水平。【结果】从550只猕猴中分离到8株五日热巴尔通体菌株,带菌率为1.5%;直接PCR检测550份全血核酸的总感染率为8.2%。普通猕猴血清阳性率为19.0%,感染水平明显高于食蟹猕猴(5.6%)。五日热巴尔通体与汉赛巴尔通体RAPD指纹图谱的带型完全不同,猴源和人源五日热巴尔通体菌株Fuller带型基本一致。不同宿主来源菌株核苷酸多态性分析显示,猴源菌株之间差异小,其与人源菌株差异较大。【结论】中国猕猴五日热巴尔通体感染水平较高,普通猕猴自然感染率及抗体水平明显高于食蟹猕猴,猴源与人源菌株的基因型有明显差异。     

巴尔通体液体培养条件简化及生长曲线观察

【目的】应用一种昆虫细胞培养基作为基础成分培养巴尔通体(Bartonella species),建立一种操作方便、高效稳定的巴尔通体液体培养方法。【方法】昆虫细胞培养基中添加10%胎牛血清,以此为基础培养液分别添加蔗糖和谷氨酰胺,比较这两种成分对汉赛巴尔通体(B.henselae)和五日热巴尔通体(B.quintana)生长的影响并观察其他10种巴尔通体在简化后的培养液中的生长特性。【结果】添加蔗糖和谷氨酰胺不会明显促进巴尔通体的生长,10种巴尔通体在简化后的培养液中均生长良好。不同种巴尔通体生长曲线不同,汉赛巴尔通体和五日热巴尔通体的世代时间分别为5.2 h和4.3 h,生长速度快于固体培养。【结论】以昆虫细胞培养基作为基础成分的培养液适于巴尔通体液体培养,特别是对一些更难培养的巴尔通体提供了一种较好的培养方法。