宫颈癌患者核糖核酸酶抑制因子基因突变的分析

目的通过对宫颈癌患者血液核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因RNH的突变分析,探讨RNH基因与肿瘤生长的关系。方法针对RNH全基因序列设计21对引物,PCR扩增后采用SSCP对突变进行检测。结果正常人和宫颈癌患者均扩增出相应的21个条带,未发现异常;经过SSCP分析未发现所收集的18例宫颈癌患者血液中的RNH基因有突变发生。结论尚不能肯定RNH基因的突变是否与肿瘤无关,也不能肯定其他肿瘤没有发生突变。需缩小检测片段进一步实验。     

核糖核酸酶抑制因子对H_2O_2损伤的大鼠神经胶质瘤细胞系C6的影响

核糖核酸酶抑制因子 (ribonucleaseinhibitor,RI)是广泛存在于哺乳动物细胞浆中的一种酸性糖蛋白 .为了进一步了解RI的功能 ,根据RI分子结构富含巯基的特点 ,研究了RI对过氧化氢(H2 O2 )损伤的大鼠神经胶质瘤细胞 (C6 )的影响 .用不同浓度的H2 O2 分别作用于转染有RIcDNA并且RI过表达的C6细胞和正常C6细胞 ,对比损伤前后 2者的细胞存活率、LDH漏出量、细胞内GSH和MDA含量差别 ,以及细胞内抗氧化酶类GPX、CAT和GST活性的差别 .结果表明 ,与正常C6细胞相比 ,RI过表达的C6细胞在H2 O2 作用下存活率高 ,LDH漏出量、MDA含量明显减少 ,而细胞内GSH较多 ;RI过表达的C6细胞在损伤前后均表现出更强的CAT和GST活性 .提示RI具有抗氧化功能 ,能够减轻H2 O2 所致的细胞过氧化损伤 .     

双歧杆菌对人大肠癌HT_(29)细胞谷胱甘肽巯基转移酶基因的诱导表达

应用北杂交技术研究双歧杆菌对大肠癌HT29细胞谷胱甘肽巯基转移酶基因的诱导表达发现:双歧杆菌及其发酵过滤液在作用HT29细胞2小时后,谷胱甘肽巯基转移酶基因的mRNA分别提高1.4倍和1.3倍,提示诱导谷胱甘肽巯基转移酶基因的高效表达,阻断外来致癌物的亲核攻击可能是双歧杆菌抗肿瘤的一个分子机制。     

质粒YRP7的基本特性鉴定

质粒YRP7用氯霉素法扩增,碱变性裂解法提取,酸酚法及核糖核酸酶纯化后,得到了高产量(5.6mg/L培养液),高纯度(A260:A280=2.0)的质粒制品,经转化实验及酶切分析确定YRP7具有下列特征:大小为5.41±0.10kb,可赋予宿主细胞AmP~r、Tet~r的表型,对大肠杆菌C600的转化频率为10~(-6)、转化效率为1.5×10~6转化子/mgDNA。限制性内切酶BamH Ⅰ、ECoRⅠ、Hind Ⅲ及PstⅠ在其分子上的切点数分别为1、2、2、2,并确定了各酶切片段的分子大小,对BanHⅠ的单切点,经插入失活法证实其位于Tet~r的基因上。由上述特征可确定,质粒YRP7是一个比较理想的克隆载体。     

转染人核糖核酸酶抑制因子基因对B16黑色瘤细胞及肿瘤转移的影响(英)

人核糖核酸酶抑制因子(human ribonuclease inhibitor, RI)是一种细胞质中分子质量为50 ku的酸性糖蛋白.RI能抑制核糖核酸酶A（RNase A）的活性, RNase A与血管生成因子（angiogenin,Ang）的氨基酸有着高度保守的同源序列.Ang是RNase A超家族的一员,RI通过与RNase A和Ang的紧密结合而抑制其活性.血管生成及新血管的形成, 是肿瘤发生和转移的必要条件.所以抗血管生成将是一种很有希望的对抑制肿瘤生长和转移的有效方法.实验显示RI能有效地抑制肿瘤诱导血管的生成.RI由含有许多亮氨酸重复序列的多肽组成.含有这样重复序列的100多种蛋白质显示了广泛的功能,包括细胞周期调节,DNA修复,对细胞外基质相互作用以及抑制酶活性等.RI被认为是胚胎发育,创伤愈合及肿瘤发生中新血管形成的一种调节因子.RI定位于染色体的11p15.5,与ras基因邻近,在肿瘤病人中经常存在染色体11p15.5部位的变异和异常.RI可能与细胞的生长和分化有关, 因此,RI 可能还具有尚未知的生物学作用.为了进一步了解RI的潜在功能以及探讨RI与肿瘤浸润、转移的关系, 将人的核糖核酸酶抑制因子基因的cDNA通过逆转录包装细胞PA317,并转染到B16小鼠黑色瘤细胞中, 用转染空载体和未转染的B16细胞作为对照.通过PCR, RT-PCR, 蛋白质免疫印迹, 免疫荧光分析鉴定,获得稳定表达人核糖核酸酶抑制因子的细胞株.结果显示, 转染的RI基因在体外能显著地抑制细胞增殖和细胞迁移,增加了细胞的粘附以及改善细胞的恶性形态,B16,B16 pLNCX,B16 pLNCX-RI 3种细胞的倍增时间分别为(24.98±0.16) h, (25.62±0.28) h, (32.64±1.11) h.与对照组相比,转RI的细胞粘附率增加17.8%和19.5%而迁移降低了61.4%和60%.转RI的细胞比对照组细胞较平展,核仁和分裂相较少,胞质嗜碱性减弱,提示细胞增殖活性降低和恶性表型的改善. 将3种B16细胞静脉注射到C57BL/6小鼠中, 结果表明, 转染RI基因的实验组显著地抑制了肿瘤的转移, 与两个对照组相比,荷瘤小鼠有更长的存活时间, 少得多的转移节结, 更低的肿瘤血管密度和肺重量.结果显示,RI的表达可能与黑色瘤的转移有关, 提示RI能显著地抑制肿瘤的转移,可能由于其与抑制血管作用,增加细胞粘附,降低细胞迁移及增殖有关.     

高表达人核糖核酸酶抑制因子的乳腺癌细胞株的建立及其鉴定

目的建立稳定高表达人核糖核酸酶抑制因子（hRI）的真核细胞系：乳腺癌细胞系,为进一步研究hRI抗肿瘤、抗氧化的作用机制奠定实验基础。方法将hRI通过逆转录病毒载体（pLNCX-hRI）经过病毒包装细胞（PA317）包装后的高滴度病毒上清,感染乳腺癌（MCF-7）细胞系,经G418筛选后,运用RT-PCR、Western blot等方法进行鉴定hRI在MCF-7中的高表达。结果hRI克隆到乳腺癌细胞（MCF-7）基因组,并随着基因组稳定高表达hRI。结论利用逆转录病毒载体感染真核细胞后获得高表达hRI的肿瘤细胞株,从而为进一步研究真核细胞内hRI的抗肿瘤作用机制提供条件。     

凋亡信号调节激酶1对细胞凋亡的调节作用

细胞存活与凋亡之间的平衡是多细胞生物正常发育与稳态的关键。细胞凋亡是受多种因素高度调控的细胞程序性死亡过程。凋亡信号调节激酶 1 (ASK1 )是促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶家族的成员之一 ,它分别激活SER1 JNK和MKK3 MKK6 p38途径 ,在细胞因子及应激诱导细胞凋亡过程中起着关键作用。TNF受体和Fas信号转导系统在抗凋亡与促凋亡过程中发挥重要作用 ,其中包括TNF受体Ⅰ相关死亡域蛋白 (TRADD)、Fas相关死亡域蛋白 (FADD)等多种蛋白因子。细胞色素C是线粒体依赖性死亡信号 ,受Bcl 2家族蛋白的调节。反应性氧化合物的氧化激活使硫氧还蛋白 (Trx)氧化 ,并与ASK1分离 ,从而激活ASK1造成细胞凋亡。总之 ,许多促凋亡与抗凋亡因子组成复杂的、相互拮抗的机制。在信号转导的各种不同的关卡上 ,这些因子的平衡作用最终决定细胞的生与死。     

绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子表达载体pEGFP-C1-hri的构建及鉴定

目的构建表达绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的表达载体pEGFP—C1—hri,为探讨人核糖核酸酶抑制因子抗肿瘤作用的分子机制打下基础。方法用亚克隆法,将目的片段从表达载体pGEX-6p-1-hri克隆到pEGFP-C1上,用双酶切筛选得到阳性重组质粒pEGFP—C1—hri,用脂质体法将其瞬时转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中,在荧光显微镜下检测其表达。结果pEGFP—C1—hri中插入了hri序列,绿色荧光高效表达于B16细胞浆中。结论pEGFP—C1—hri表达载体已成功构建。     

重组白眉蝮蛇去整合素定点突变对其生物活性的影响

RGD为存在于许多糖蛋白配体中的氨基酸序列,对整合素具有识别作用.此序列也发现于许多蛇毒去整合素分子中.采用基因克隆技术从大连产白眉蝮蛇的毒腺中克隆出的去整合素adinbitor是含73个氨基酸残基的去整合素,分子中含有12个半胱氨酸和RGD模体.实验证明,adinbitor作为去整合素的新成员,具有典型的抗ADP诱导的人血小板聚集作用和抗肿瘤血管新生作用.为了将adinbitor的这2种功能分开,采用PCR基因定点突变的方法,将其cDNA序列中RGD模体改变成KGD.重组adinbitor(KGD)在E.coli BL21得到表达,并通过His•Bind亲和层析予以纯化.实验发现,adinbitor对ADP诱导的人血小板聚集具有明显抑制作用,其IC50=85 nmol/L,明显优于adinbitor(RGD) （IC50=150 nmol/L）.然而,与adinbitor(KGD)相比,adinbitor(KGD)则丧失了对血管生成的抑制作用.结果说明,adinbitor(KGD)可作为专一的抗人血小板聚集药具有潜在的开发前景.     

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法诊断轮状病毒腹泻的研究

轮状病毒是致人及动物腹泻的一个重要病原,从Bishop等用电镜从粪便中发现了该病毒以来,相继出现了许多有效的检测方法。由于轮状病毒的基因组是具有11节段的双股RNA,因此可用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法进行检测。轮状病毒的RNA在电泳中形成了11个片段的迁移区带图,称为电泳型(electropherotype),不同种型的轮状病毒其电