真空微波诱变结合化学诱变选育酸性纤维素酶高产菌株

以酸性纤维素酶产生菌绿色木霉（Trichoderma viride）WL0512作为原始出发菌株,首先经自然分离筛选出一株产酶较稳定的菌株TVN-18,其羧甲基纤维素酶活（CMC酶活）达2765．8U／g,滤纸酶活（FPA酶活）达48．5U／g。再经真空微波和甲基磺酸乙酯（EMS）逐级诱变处理,获得了一株高产、稳产酸性纤维素酶的E6—1菌株,其CMC酶活达4396．6U／g,FPA酶活达126．0U／g,分别是菌株TVN-18的1．59倍和2．60倍。通过对固态发酵培养基麸皮和稻草比例、料水比以及初始pH值的优化,突变株的产酶能力进一步得到提高,其产的CIVIC酶活和FPA酶活分别提高了22．3％和22．4％。     

绿色荧光蛋白在微生物根际定殖研究中的应用

农业有益微生物根际定殖能力的强弱决定着其应用效果的好坏,而作为荧光标记分子的GFP被认为是当前用于分子生态学研究中最理想的报告基因,成为近年来研究微生物根际定殖的热点方法.简要介绍GFP的一些特性及其在微生物根际定殖研究中的应用与前景展望.     

八肋游仆虫含绿色荧光蛋白基因的大核人工染色体的构建

为研究八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)相关基因的功能,构建了八肋游仆虫大核人工染色体(macronuclear artificial chromosome of E. octocarinatus,EoMAC-G),其两端为克隆自八肋游仆虫大核β2-微管蛋白基因的5′和3′非编码区和两侧的端粒序列,中间为多克隆位点和密码子优化后的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP-Eo) 报道基因. 用脂质体转染方法将携带有EoMAC－G的pBTub-Tel载体转入八肋游仆虫大核,分析EGFP-Eo基因在八肋游仆虫细胞中的表达. 荧光显微镜观察发现,EGFP-Eo产生的荧光均匀分布于八肋游仆虫细胞质中. 在细胞进行有丝分裂的情况下,荧 光可持续20 d以上. 相比pEGFP-N1质粒转化的游仆虫,人工染色体中的EGFP-Eo基因表达的荧光亮度强、稳定且持续时间长. Western 杂交分析进一步证实,外源EGFP-Eo基因在细胞中过量表达. 通过细菌喂食法进行纤毛虫RNA干扰实验,抑制了外源EGFP-Eo基因在八肋游仆虫细胞中的表达. 利用构建的人工染色体不仅可以在八肋游仆虫细胞内表达外源基因,对目的蛋白质进行活细胞实时动态的定位分析,还可通过RNA干扰的方法调控外源基因在纤毛虫细胞中的表达,便于进一步分析目的蛋白质的功能.     

快速直视筛选结缔组织生长因子特异RNA干扰序列

利用一种快速简便经济直接的筛选特异RNA干扰序列的方法,筛选结缔组织生长因子（CTGF）基因特异RNA干扰序列.设计合成分别含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,以pTM1-CTGF为模板PCR获得CTGF基因,定向克隆入pSOS-HUS质粒得到质粒pSOS-HUS-CTGF. 质粒pSOS-HUS-CTGF经过SfiⅠ酶切后分别与5条CTGF干扰序列和1条随机对照序列克隆获得pSOS-CTGFi1,pSOS-CTGFi2,pSOS-CTGFi3,pSOS-CTGFi4,pSOS-CTGFi5,pSOS-CTGFicontrol.质粒转入HEK293细胞中,于第1、3、5、7 d倒置荧光显微镜照相,IPP图像分析软件测定光强度值.5种CTGF特异RNA干扰载体的相对光强度分别为0.24%、41.47%、2.93%、20.40%和28.85%. 特异性序列site 1和site 3的沉默效果最好. pSOS-HUS系统采用双向启动子,通过绿色荧光蛋白下调水平来衡量干扰序列的沉默效果具有可靠直观重复性好的优点.利用该方法成功筛选了高沉默效果的CTGF特异RNA干扰序列.     

农杆菌介导的MpASR蛋白在洋葱表皮细胞的定位研究

通过比较不同侵染液浓度、侵染时间、取材部位、预处理等条件下的转化效果,优化了农杆菌介导的洋葱鳞茎内表皮细胞转化系统,并且成功检测到大蕉ASR蛋白(MpASR)与GFP的融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布.     

一种基于绿色荧光蛋白的蛋白酶体抑制剂细胞筛选模型

为建立基于绿色荧光蛋白(GFP)的药物筛选模型,并用此模型从包括中药提取物在内的化合物中筛选新型蛋白酶体抑制剂,本研究构建了pGC-E1-ZU1-GFP融合蛋白慢病毒表达载体并感染A549细胞,筛选稳定表达细胞株,用已知蛋白酶体抑制剂PS-341处理细胞,荧光显微镜检测处理前后细胞GFP水平变化。结果获得了稳定表达pGC-E1-ZU1-GFP的A549细胞,这些细胞用PS-341处理24h后用荧光显微镜检测,发现细胞绿色荧光强度相对于对照组明显增强。利用这一模型对一些化合物进行筛查,发现了一些新的蛋白酶体抑制剂。     

慢病毒介导的GFP转染对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、细胞表型及脑脊液诱导后分化能力的影响

摘要 目的：研究慢病毒（Lentivirus）介导的绿色荧光蛋白（Lentivirus-GFP）转染大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的可行性及稳定性,以及对人脑脊液诱导转染后BMSCs（BMSCs-GFP）成神经分化能力的影响。方法：全骨髓贴壁法培养BMSCs,Lentivirus-GFP以5、10、30、50的感染复数（MOI）转染BMSCs,96h后倒置显微镜下观察GFP转染效率和表达情况,筛选最适MOI;流式细胞术检测细胞表型;CCK8法检测细胞活力。人脑脊液诱导BMSCs-GFP向神经细胞分化,蛋白印迹法检测神经细胞表面标记物MAP-2和Nestin表达。结果：全骨髓贴壁法分离培养的BMSCs生长旺盛。MOI值为5、10、30、50的转染效率分别为56.2%、87.3%、94.7%和95.1%,当MOI为30时,Lentivirus-GFP转染BMSCs效率较高,且对BMSCs生长状态无显著性影响。BMSCs-GFP表达CD29、CD90,较少表达CD45、CD54,符合干细胞特性。BMSCs-GFP增殖活性与未转染GFP基因的BMSCs相比,差异无统计学意义（P>0.05）。人脑脊液诱导BMSCs-GFP成神经细胞分化后表达神经元标记物MAP-2和Nestin。结论：Lentivirus-GFP能高效稳定转染大鼠BMSCs（最适MOI值为30）,同时不影响其生物学特性,人脑脊液能诱导BMSCs-GFP成神经细胞分化。     

基于天然低共熔溶剂的甜叶菊中甜菊糖绿色提取方法及优化

尝试利用天然低共熔溶剂(NADES)提取甜叶菊(Stevia rebaudiana)中的甜菊糖, 探索一种高效、绿色和环保的甜菊糖提取新方法。以甜叶菊干叶为原料, 对照传统提取溶剂水, 以甜菊糖中甜菊苷和莱鲍迪苷A的提取浓度作为指标, 筛选出最优的NADES提取配方, 然后通过Box-Behnken响应面法对NADES提取甜叶菊中甜菊糖的工艺条件进行筛选优化。结果表明, 提取效率最高的NADES配方为1,2-丙二醇:甘油:水=8:1:1 (v/v/v), 提取的甜菊苷浓度为2.59 mg∙mL^-1, 比水提取高16.40%, 提取的莱鲍迪苷A浓度为1.06 mg∙mL^-1, 比水提取高12.62%; 通过响应面法得到最优提取条件: 提取时间90分钟, 提取温度60°C, 超声功率为80 J∙s^-1, 预测甜菊苷提取浓度为3.49 mg∙mL^-1, 莱鲍迪苷A提取浓度为1.43 mg∙mL^-1, 与实验验证值(甜菊苷浓度为3.48 mg∙mL^-1, 莱鲍迪苷A浓度为1.42 mg∙mL^-1)接近。在最优条件下, 甜菊苷提取浓度比初始条件提高了34.36%, 莱鲍迪甘A提取浓度比初始条件提高了33.96%。NADES绿色环保, 且提取效率高于传统溶剂, 可用于甜叶菊中甜菊糖的绿色提取; 同时, 该提取方法可为后续推广至其它大宗经济植物类天然产物的绿色工业生产提供参考。     

绿色视野下的初中物理教学

"绿色"教学是一种新的教学理念,"绿色"物理教学就是要以学生为本位,尊重学生的个性发展,把物理学习的主动权还给学生,让学生真正地快乐学物理、享受物理。它强调的是一种变化的、充满勃勃生机的可持续发展的物理课堂教学,物理教学需要回归到"绿色"的原生态中。     

利用荧光分光光度计定量分析GFP基因的表达水平

以3种表达水分高低不一的绿色组织特异性启动子驱动绿色光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因转化烟草植株,设计了一种利用荧光分光光度计对组织中GFP的表达水平进行定量分析的新方法,利用该方法对获得的102株转基因烟草中不同部位叶片中的GFP表达水平进行了定量分析.其结果与荧光显微镜观察结果高度一致,从而证实利用这种新方法对GFP基因进行定量分析是可行的。