一个RNAi载体上反向重复片段的测序策略

相邻的反向重复DNA片段有形成单链内二级结构的倾向,属于一种测序困难的DNA模板。解决RNAi载体插入的反向重复片段的测序问题,为该类载体正确性的测序验证奠定基础。采用常规分子克隆方法构建表达小麦TaATG2串联反向重复片段的RNAi载体,设计2种策略对经菌落PCR初步鉴定的载体进行测序验证:一种是以完整的载体质粒为模板进行测序;另一种是先对载体进行酶切处理,切除反向重复片段中的一个后对保留另一个片段的线性载体进行测序。结果表明,第一种测序策略受到串联反向重复片段形成的单链内部二级结构的影响,测序信号在反向重复片段处出现衰减或乱峰,无法读取序列。第二种测序策略排除了2个反向重复片段之间的干扰,保留在载体上的片段测序信号清晰,序列准确。采用酶切切除一个片段后进行测序的方法,经过2次酶切和2次测序可以有效地对载体上的2个反向重复片段分别进行序列测定,进而确认构建载体的正确性。     

高效合成葡萄糖二酸酿酒酵母工程菌的构建

葡萄糖二酸是天然存在的一种重要二元酸,其在医疗保健和化工工业等领域具有很高的实际应用价值,因此被称为“最具价值的生物炼制产品之一”。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘微生物,文中考察了过量表达肌醇转运蛋白Itr1、融合表达肌醇加氧酶和葡萄糖醛酸脱氢酶以及弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1三种策略对葡萄糖二酸产量的影响。研究结果显示,过量表达肌醇转运蛋白Itr1使葡萄糖二酸产量在摇瓶发酵条件下较出发菌株Bga-3提高了26%;MIOX4-Udh融合蛋白的表达使葡萄糖二酸的产量较Bga-3菌株提高了40%;在此基础上,弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1后,葡萄糖二酸的产量达5.5 g/L,较相同发酵条件下Bga-3菌株提高了60%。在5 L发酵罐中,该菌株葡萄糖二酸的最高产量达10.85 g/L,较Bga-3菌株提高了80%。由此可见,上述代谢改造策略的应用在很大程度上提高了葡萄糖二酸的途径效率和产量,为通过代谢工程方法在酿酒酵母中合成其他化合物的研究提供了参考。     

血清铜蓝蛋白联合透明质酸检测在肝纤维化患者诊断中的应用

目的探讨血清铜蓝蛋白(CP)联合透明质酸(HA)检测在肝纤维化患者诊断中的应用前景。方法选取2015年1月至2018年12月本院收治的疑似肝纤维化患者226例为研究对象,对患者的CP、HA水平进行联合检测,根据各项指标检测水平对患者做出诊断,并与金标准诊断方法肝穿刺活检结果进行对比。对CP、HA单独检测和联合检测的诊断结果进行统计对比,并对各组检查方法的灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率、准确度等进行统计对比,比较不同检查方法在不同肝纤维化分级患者中的诊断正确率。结果 226例患者中金标准诊断201例(88.94%)为肝纤维化,CP单独检测检出154例(68.14%),HA单独检测检出143例(63.27%),CP+HA联合检测检出195例(86.28%)。经Kappa一致性检验分析CP+HA联合检测与金标准结果有高度一致性,CP、HA单独检测与金标准结果为中等一致性。CP+HA联合检测的灵敏度、特异度、准确度均高于CP、HA单独检测,方法间比较差异有统计学意义(χ~2=11.602、55.959、78.047,P=0.003、0.039、0.002)。在不同分级肝纤维化患者中,CP+HA联合检测在Ⅰ级、Ⅱ级纤维化检出率高于CP、HA单独检测,方法间比较差异有统计学意义(χ~2=9.432、8.324,P=0.007、0.010)。结论 CP联合HA检测在肝纤维化患者诊断中应用情况良好,有较高的诊断正确率,且对症状程度较轻的肝纤维化患者有较高的检出率,可作为肝纤维化诊断检查的主要手段加以推广应用。     

PET-CT在非完全实性肺结节中的应用价值

肺癌在中国恶性肿瘤的发病率位居第一,随着低剂量薄层CT在肺癌筛查中的广泛应用,临床发现更多表现为非完全实性结节的肺腺癌,目前众多研究使CT影像学特征和肺腺癌病理的关系得到更进一步的认知,虽然CT能对部分非完全实性结节做出定性和定位诊断,但仍有部分非完全实性结节诊断困难,PET-CT结合了病灶的代谢信息和精确的定位信息,从而提高对肺部结节诊断的敏感性、特异性、准确性,综合多个文献PET-CT在非完全实性结节中的诊断分期价值较CT无明显提升,却在评估预后和制定合适手术方案上可以起到一定的作用,本文就PET-CT在SSN中的应用价值进行阐述。     

蛋白质纯化虚拟仿真课程的教学设计

目的 蛋白质纯化是医学与生物学实验教学课程中的一个重要内容，本文通过设计新的蛋白质纯化虚拟仿真教学内容，开发虚拟仿真教学系统，希望学生能够更有效率地掌握蛋白质纯化技术的要点，提升教学质量。方法 利用3D虚拟仿真技术，构建虚拟仿真实验室。结合线下教学经验，确定虚拟仿真教学中需要体现的教学内容、教学重点、核心仪器的特色、评分指标、考核方式、操作体验等。结果 本文基于3D虚拟仿真技术构建了蛋白质纯化虚拟仿真实验室，和传统教学相比，虚拟仿真教学可以提高教学效率，节省教学成本和场地占用；教学设计和虚拟仿真教学系统融合了教学、练习和考核模块，根据以往的教学经验优化了评分体系，保证学生更加有效、严谨地掌握技术细节；涵盖了全新的教学内容——荧光检测联用的分子排阻层析，添加了蛋白质层析的常用案例，保证了内容的新颖与实用；完全再现了现实实验室中仪器设备的搭建模式，实现虚拟学习与实际操作的无缝衔接。结论 蛋白质纯化虚拟仿真教学系统由虚及实，由点及面，把控细节，保证学生动手能力和探索能力的提高，学以致用，并且拥有传统教学模式不可比拟的优势。     

酸敏感离子通道与脑梗死

急性脑梗死约占全部脑卒中的70%,病死率和致残率高,且极易复发。但目前针对急性脑梗死在时间窗内溶栓、抗凝等治疗手段不能从根本上切实有效地修复受损脑组织,且伴有出血等风险。寻找脑梗死形成发展的原因并予以治疗迫在眉睫。酸中毒是引起缺血性脑损伤的重要机制。大量实验研究表明,酸中毒能加重神经元的缺血性损伤,且其梗死面积与酸中毒的程度直接相关。但缺血产生的酸中毒如何引起神经元损伤的确切机制尚不明确。最近研究发现酸中毒能激活一种在中枢及周围神经中广泛存在的膜通道,即酸敏感离子通道,它对Ca2+通透,能引起细胞内Ca2+超载,同时能激活胞内酶引起细胞内蛋白质、脂类及核酸的降解,加重缺血后脑损伤。本文就酸敏感离子通道1a与脑梗死做一综述。     

STZ诱导的糖尿病模型小鼠肾脏的上皮-间质转分化研究

目的:探讨STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏发生上皮-间质转分化(EMT)的情况。方法:将80只C57BL小鼠随机分为正常对照组(NC组)和糖尿病组(DM组),每组40只。DM组小鼠用1%STZ(streptozotocin,链脲佐菌素)溶液按60mg/kg体质量的剂量进行腹腔注射,每天1次,连续6天。NC组小鼠平行腹腔注射同等体积0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液。再将成模小鼠随机分为A、B批次,A批次用于动态观察生存率、小鼠体质量及随机血糖的监测;B批次用于在造模后第4、8、12周末观察肾组织的病理变化,并用Western blot、免疫荧光染色的方法观察肾组织中EMT标志蛋白α-SMA和E-cadherin的表达。结果:STZ诱导的糖尿病模型小鼠出现糖尿病典型症状如多饮、多尿等,血糖持续在高水平状态,体质量增长缓慢。在造模后12周末,DM组小鼠较NC组小鼠累积生存率显著降低,两组比较差异具有统计学意义(P0.001)。在造模后的第8周末,DM组小鼠肾脏出现明显的病理改变,到第12周末时,绝大部分肾小管上皮细胞被梭形的肌成纤维细胞取代,肾小球空泡,基底膜增厚。造模后的第4、8、12周末时,DM组小鼠E-cadherin表达量均显著低于NC组小鼠(P=0.004,0.026,0.004);而在第8和12周末时,DM组α-SMA表达量显著升高(P=0.009,0.015)。在第12周末,肾组织冰冻切片E-cadherin和α-SMA、免疫荧光染色结果与上述结果一致。结论:STZ诱导的糖尿病模型小鼠有较典型的糖尿病临床改变,且肾组织发生了EMT。