沙蒿AQP基因结构预测及干旱胁迫下的时空表达模式研究

为探究水通道蛋白(AQP)在沙蒿响应干旱胁迫中的作用机制,该研究以青海省柴达木盆地沙蒿为试验材料,采用RACE技术对其AQP基因进行扩增,获得沙蒿AQP全长克隆并对AQP蛋白进行结构预测和分析;采用qRT-PCR对沙蒿AQP基因在不同程度干旱胁迫以及不同组织部位的表达模式进行分析。结果表明:(1)成功克隆获得沙蒿AQP基因长746 bp的片段1和长534 bp的片段2,经拼接后得到全长cDNA序列,沙蒿AQP基因总长为864 bp。(2)亚细胞定位表明沙蒿AQP基因定位于细胞膜上;同源比对显示沙蒿与向日葵、莴苣、橡胶树等植物的AQP基因具有较高的相似性;结构预测表明AQP蛋白含6个跨膜螺旋结构且亲水性较弱,α螺旋和无规则卷曲为AQP蛋白二级结构的主要构成元件。(3)qRT-PCR分析表明,沙蒿AQP基因随着干旱胁迫的加重呈现有规律的变化,根、茎、叶中表达均上调,且叶中AQP基因表达量上调幅度最大。研究表明沙蒿AQP基因结构特征及其表达模式都是沙蒿对干旱胁迫的一种适应。     

马铃薯硝态氮转运蛋白基因的克隆及表达分析

该研究以马铃薯双单倍体‘DM’为材料,克隆到高亲和性硝态氮转运蛋白基因StNRT2.1的全长cDNA(JGI登录号PGSC0003DMT400002924),并对其进行表达模式和生物信息学分析,为深入探索StNRT2.1基因的生物学功能以及提高马铃薯对氮素的利用效率奠定理论基础。结果表明:(1)通过同源克隆与PCR扩增获得StNRT2.1基因cDNA全长片段,并构建pCEGFP-StNRT2.1表达载体;测序结果显示其实际所编码的蛋白质序列与数据库中目的基因蛋白质序列完全一致,表明成功克隆到StNRT2.1基因且未出现错义突变。(2)StNRT2.1基因位于马铃薯第11号染色体,cDNA序列全长1 593 bp,编码530个氨基酸,预测蛋白相对分子质量约为57.60 kD,理论等电点为9.36。(3)生物信息学分析显示,StNRT2.1由20种氨基酸组成,其中甘氨酸(Gly)所占比例最多,达到10.8%,并且主要由228个α-螺旋、27个β-折叠、87个延伸链和188个无规则卷曲构成;StNRT2.1存在功能保守结构MFS_1(PF07690)和12个跨膜螺旋结构域,且N端和C端均位于细胞膜内; StNRT2.1位于质膜上且不具有信号肽,可能为非分泌型膜蛋白。(4)以氮充足(7.5 mmol/L)水平作为对照,马铃薯幼苗经无氮(0 mmol/L)和低氮(0.75 mmol/L)处理3周后呈现出叶片发黄及植株矮化等明显表型差异。(5)qRT-PCR结果显示,在无氮条件下,马铃薯根组织中StNRT2.1基因表达量升高3.98倍,说明StNRT2.1可能为诱导型高亲和转运蛋白。     

火烧高温对泥炭藓孢子萌发力影响的模拟实验

作为生态系统稳定性维持的一个重要因素,火对泥炭地优势植物泥炭藓(Sphagnum)孢子库的影响尚不清楚.以采自长白山区泥炭地的泥炭土和3种泥炭藓的成熟孢子为实验材料,室内模拟火烧,以此设置不同温度水平(20、40、60或100℃,持续0.5、1、2、4或10 min),对泥炭藓孢子进行热激处理,经萌发实验后,研究火烧高温对孢子萌发率的影响.结果显示,火烧期间各层土温随深度而递减,表层泥炭可达300℃的极端高温,而1 cm深温度仅为70℃,体现出泥炭土良好的热缓冲性;40℃的热激可使锈色泥炭藓(S.fuscum)与中位泥炭藓(S.magellanicum)孢子萌发率提高20%与50%;60℃的热激使尖叶泥炭藓(S.capillifolium)孢子的萌发率提高1倍;100℃热激对3种泥炭藓孢子萌发则有强烈的抑制作用.研究表明,泥炭藓孢子耐受高温的能力有限,但土壤中的孢子凭借泥炭的良好热缓冲性,可以躲避火烧高温造成的致命伤害,适度的热激甚至能提高其萌发力,对其在火后的建植及种群的长存可能有重要意义.     

高糖诱导的大鼠原代心肌细胞损伤对程序性坏死的影响及其机制*

目的: 探讨程序性坏死在高糖诱导的大鼠原代心肌细胞损伤中的变化及可能机制。方法: 原代大鼠心肌细胞随机分为4组(n=9):正常对照组(Control,5.5 mmol/L葡萄糖培养心肌细胞48 h)、高糖组(HG,30 mmol/L葡萄糖培养心肌细胞48 h)、HG+Nec-1(30 mmol/L葡萄糖+100 μmol/L程序性坏死关键蛋白RIP1抑制剂Nec-1共同培养心肌细胞48 h)组、高渗组(HPG,5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇共同培养心肌细胞48 h)。MTT法检测各组心肌细胞活力,DHE荧光染色检测细胞氧化应激水平,ELISA法检测心肌细胞TNF-α、IL-6及IL-1β水平,Real-time PCR和Western blot分别检测各组程序性坏死关键蛋白RIP1、RIP3、MLKL mRNA和蛋白水平的表达情况。结果: 与Control组相比,HG组心肌细胞活力明显降低(P＜0.01),氧化应激水平明显增高(P＜0.01),TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高明显(P＜0.01),RIP1、RIP3、MLKL mRNA及蛋白水平表达均明显升高(P＜0.05);与HG组相比,HG+Nec-1组心肌细胞活力明显升高(P＜0.01),氧化应激水平明显下降(P＜0.01),TNF-α、IL-6及 IL-1β水平明显降低(P＜0.01), RIP1、RIP3、MLKL mRNA及蛋白水平表达均下降(P＜0.05)。结论: 高糖诱导的原代大鼠心肌细胞损伤可引起程序性坏死的发生;抑制程序性坏死可减轻细胞损伤的机制,可能与抑制氧化应激、减轻炎症反应有关。     

中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2杆状病毒表达与间接ELISA方法建立

为了检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)抗体水平,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建含有CSBV VP2的重组杆状病毒rBac-VP2,并在昆虫细胞中获得表达。用经过纯化的重组VP2蛋白作为包被抗原,建立CSBV抗体的间接酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法。结果表明成功的表达了VP2蛋白。优化反应条件后,建立的ELISA检测方法仅与CSBV阳性IgY发生特异性反应,与其它蜜蜂病毒的阳性IgY不发生交叉反应,且检测阳性IgY的灵敏度达到了1∶6 400,证明其具有良好的特异性和敏感性。批内重复与批间重复变异系数均小于10%。与CSBV全病毒包被进行比较,检测结果差异不显著,说明该方法适用于抗CSBV抗体检测。     

心理应激对小鼠脂肪组织黄嘌呤氧化酶表达、活性及相关指标的影响*

目的:探讨心理应激对小鼠脂肪组织黄嘌呤氧化酶表达、活性及相关指标的作用。方法:雄性无特定病原体(SPF)级20只昆明小鼠随机分2组(每组10只),即慢性束缚应激(Stress)组和正常对照(Control)组。Stress组小鼠每天在自制式束缚器中限制活动2 h,其余时间两组小鼠在相同环境中自由饮水摄食,实验持续14 d,取血和白色脂肪组织(WAT);观察脂肪组织病理学改变,检测WAT中黄嘌呤氧化酶(XO)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nox-4)的蛋白水平,检测WAT组织中XO、Nox-4、超氧化物歧化酶(Mn SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、脂联素(ADPN)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、胰岛素受体底物1(IRS-1)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT-4)、组织因子(TF)、纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)的mRNA表达,检测血清和WAT组织中XO酶活性以及血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-Cho)、游离脂肪酸(FFA)、尿酸(UA)的含量。结果:与control组比较,stress小鼠腹股沟WAT组织中XO免疫染色阳性着色细胞黄褐色沉淀深且丰富,WAT中出现大量的单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及浆细胞浸润反应和炎症性的改变;血清XO浓度、WAT组织中XO mRNA水平和XO的酶活性显著升高(P＜0.01),血清游离脂肪酸(FFA)和尿酸(UA)的含量显著增高(P＜0.01),WAT组织中Nox-4蛋白、MCP-1、IL-6、TNF-α、TF、PAI-1mRNA的表达水平显著增高(P＜0.01),而Mn-SOD、GSH-Px、CAT、ADPN、IRS-1和GLUT-4的mRNA水平则显著降低(P＜0.01)。结论:心理应激可诱发脂肪XO过量表达及其活性增高,进而引起脂肪炎症、糖代谢及凝血酶原异常等反应。     

RNAi靶向VP2基因抑制中蜂囊状幼虫病毒在中华蜜蜂幼虫体内复制研究

中蜂囊状幼虫病(Chinese sacbrood disease,CSBD)是造成中华蜜蜂患病死亡的主要原因之一,目前尚无有效的治疗方法。为了研究靶向中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP2基因的siRNA介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用和其对CSBV在中华蜜蜂幼虫体内复制的影响,设计合成针对CSBV VP2基因的特异性siRNA,以100 nM的浓度与pEGFPN1-VP2-CSBV融合表达载体共同转染至293T细胞中,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和分析siRNA在体外对CSBV VP2基因表达的干扰效果。同时,将siRNA(1μg/μL)和1×10~7拷贝数的CSBV共同饲喂2日龄中华蜜蜂幼虫,检测幼虫体内CSBV拷贝数和幼虫存活率,研究siR-NA对中华蜜蜂幼虫体内CSBV复制的影响。荧光结果显示,在293T细胞中siRNA能抑制CSBV VP2蛋白的表达,并且通过流式细胞仪检测分析发现干扰效果接近40%。幼虫饲喂实验表明,饲喂siRNA组在各时间点幼虫体内CSBV拷贝数均低于CSBV对照组,且在摄入siRNA后感染CSBV的幼虫存活率明显上升,与CSBV组差异极显著(P<0.01)。通过本研究,证明了针对CSBV结构蛋白VP2基因的特异性siRNA能够介导产生RNAi,影响CSBV在中蜂体内的复制,为深入研究CSBV VP2基因的功能和研发抗CSBV生物制剂提供了理论基础。     

SMB-S15细胞中朊病毒PMCA方法的建立及对白藜芦醇抗朊病毒作用的评价

朊病毒是一类能引起人或动物神经退行性疾病的感染因子。蛋白质错误折叠循环扩增(Protein misfolding cy-clic amplification,PMCA)是一种常见的朊病毒体外扩增技术。白藜芦醇是一种具有较高研究价值的植物抗菌素。为了建立SMB-S15细胞中朊病毒的PMCA体系,并探索PMCA技术在评价白藜芦醇抗朊病毒作用的意义,本研究以朊病毒感染细胞系SMB-S15细胞匀浆为种子,健康小鼠脑组织匀浆为底物,建立PMCA技术平台。将不同浓度的白藜芦醇导入PMCA体系,通过Western Blot方法检测PMCA产物中异常朊蛋白(PrPSc)的生成和变化。结果显示:SMB-S15细胞中PrPSc可以在建立的PMCA体系有效地复制。新生成的PrPSc分子的糖基化特征与原始细胞中的PrPSc不同,其双糖基化分子比例明显增加。同时也有别于羊瘙痒因子139A和ME7感染小鼠脑组织中的PrPSc分子。加入白藜芦醇后,PrPSc在PMCA体系中的复制明显被抑制,呈现出剂量依赖效应,其EC50约为4.616μM。这些结果表明:SMB-S15细胞中的PrPSc可以通过PMCA大量扩增,建立的PMCA技术可有效地反映白藜芦醇对PrPSc在体外复制的抑制作用。