砀山酥梨多酚氧化酶基因(PbPPO)的原核表达及优化研究

从砀山酥梨Pyrus bretschneideri ‘Dangshan Su’果实中克隆得到一条多酚氧化酶基因(PbPPO)的全长cDNA序列(GenBank登录号:JF809859)。通过生物信息学分析表明,PbPPO基因CDS区全长1782 bp,编码593个氨基酸,氨基酸序列由N端叶绿体转运肽、Cu结合区与C端疏水区三部分组成。为进一步研究Pb PPO基因的功能,成功构建其原核表达载体pET-28a-PbPPO,并在大肠杆菌Rosetta菌株中成功诱导表达,经优化后显示,在28℃、1.0 mmol·L~(-1) IPTG诱导5 h的条件下,融合蛋白表达量最高。     

草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6的克隆及异源表达

【目的】克隆草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA,证实其编码的蛋白具有漆酶活性,最终建立草菇漆酶基因的异源表达及纯化体系。【方法】利用RACE技术克隆全长cDNA序列,并利用生物信息学技术进行序列分析,在此基础上,去除全长cDNA的编码信号肽的序列并在3'端添加His-tag碱基序列,把修饰后的cDNA片段克隆到表达载体pPIC9K上,并转化到毕赤酵母GS115中进行表达,对重组蛋白利用Ni柱进行分离纯化并以ABTS底物法检测重组蛋白的漆酶活性。【结果】vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA的长度分别为1599 bp和1554 bp,且分别含有19和15个外显子;其编码的蛋白的理论分子量分别是57.3 kDa和56.3 kDa,理论等电点分别为4.73和5.62,且都属于分泌型的胞外蛋白;表达出的重组蛋白RBvvlac1和RBvvlac6,其分子量大小约为70 kDa,说明存在翻译后修饰;含有150 mmol/L咪唑的缓冲液对RBvvlac1和RBvvlac6发酵液进行洗脱所得到的蛋白溶液具有最高漆酶活性(333.17 U/L和227.63 U/L)。【结论】草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6能够编码有活性的漆酶蛋白,本研究建立的异源表达及纯化体系适用于草菇或其它漆酶基因的异源表达与纯化。     

马铃薯StPSKRs基因的克隆及其亚细胞定位分析

该研究采用同源克隆与PCR扩增方法,从马铃薯品种‘Desiree’中克隆植物磺肽素受体基因StPSKR1和StPSKR2的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析及亚细胞定位分析,为深入研究StPSKR1和StPSKR2基因在马铃薯生长发育和生物胁迫中的作用提供理论依据。结果发现:(1)通过同源克隆与PCR扩增获得StPSKR1和StPSKR2的全长cDNA片段,并将其克隆到pGWB5-GFP载体;测序结果显示这2个基因编码的蛋白质与数据库给定的蛋白质序列保持一致,表明成功克隆到StPSKR1和StPSKR2基因。(2)StPSKR1位于马铃薯1号染色体上,cDNA全长3 042 bp,编码1 013个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为112.16 kD,理论等电点6.27;StPSKR2位于7号染色体,cDNA全长3 135 bp,编码1 044个氨基酸,相对分子量为114.99 kD,理论等电点6.19。(3)生物信息学分析显示,StPSKR1和StPSKR2都属于跨膜蛋白。(4)亚细胞定位结果显示,StPSKR1和StPSKR2均定位于细胞膜上。     

无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的克隆及原核表达

以灭活的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)诱导后的吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆到吉富罗非鱼(O.niloticus)分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。sIgM基因cDNA全长为1 921 bp,开放阅读框(ORF)为1 740 bp,5'端非编码区(5'-UTR)41 bp,3'端非编码区(3'-UTR)140 bp,编码579个氨基酸,N端有信号肽结构。预测分子量(MW)为64.26 kD,理论等电点(pI)为5.36。系统进化树分析显示,吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)的亲缘关系较近。sIgM基因有4个恒定区。将吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-sIgM,诱导表达后确定最优条件为37℃条件下,IPTG浓度为0.05 mmol/L时诱导4 h蛋白表达量最大。纯化蛋白后经Western blot分析,sIgM融合蛋白与鼠抗His-Tag发生特异结合,表明目的蛋白成功表达。     

苎麻转录因子基因BnMYB3的克隆及表达分析

该研究采用RACE技术,从苎麻中克隆到1个MYB转录因子基因(BnMYB3)的全长cDNA序列(GenBank登录号为MF741320.1)。生物信息学分析表明,BnMYB3基因cDNA全长为1 216bp,包括900bp编码区序列,编码含有299个氨基酸的蛋白,其分子量约为33.63kD,理论等电点为9.16;该蛋白质含有2个典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB。从苎麻基因组中克隆了BnMYB3基因1 681bp启动子序列,该序列包含ABRE、GARE-motif、CGTCA-motif和TGACG-motif等多个逆境相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,BnMYB3为组成型表达基因,在茎和叶中的表达量显著高于根;BnMYB3基因能够响应镉胁迫,且表达量随镉胁迫处理时间和处理浓度的增加而显著上升。     

油茶Pht1;2的克隆及生物信息学分析

目的:克隆和分析油茶高亲和磷转运蛋白基因,为研究其结构和功能打下基础。方法:以油茶品种‘华硕’为试材,通过RT-PCR和RACE的方法克隆出油茶磷酸转运子Pht1基因家族一个成员的全长cDNA序列,命名为CoPht1;2(GenBank登录号:JX412956.1),通过生物信息学技术对其序列的理化性质、结构与功能进行分析和预测。结果:CoPht1;2 CDS长度为1 590bp,编码530个氨基酸,与其它物种的Pht1氨基酸序列具有较高的相似性,其中与杨柳科毛果杨的Pht1相似性最高,达到77.5%;该基因所编码蛋白质的分子量为58.02 kDa,理论等电点pI为8.97,二级结构主要由α-螺旋、β-折叠和不规则卷曲构成,包含12个明显的跨膜螺旋拓扑结构。结论:预测显示该蛋白是一个疏水跨膜蛋白,具有磷转运蛋白的主要特征,初步判定其与油茶磷吸收有关,其功能有待进一步验证。     

cDNA文库与RACE方法结合克隆一个马铃薯病程相关蛋白基因cDNA

为克隆马铃薯晚疫病抗性相关基因,深入研究马铃薯晚疫病抗性机制,应用SMART LD—PCR技术,以晚疫病菌混合小种诱导48h的水平抗性马铃薯(Solanum tuberosum L．)(R—gene—free)叶片为材料,构建了一个富集晚疫病抗性相关基因的cDNA文库。为提高克隆全长cDNA的效率,将cDNA文库与RACE技术结合,依据本实验室得到的病原诱导表达片段测序结果,在其内部设计两个特异引物,与文库载体臂上的通用引物配对,以文库噬菌体DNA为模板,用高保真PCR分别扩增出cDNA5′端与3′端,从而简便、快捷地得到全长cDNA序列。采用此方法,在马铃薯中克隆了一个受晚疫病菌诱导表达的cDNA,该cDNA长904bp,5′端有29bp的非翻译区,3′端具有完整的polyA尾,包含一个678bp的完整开放阅读框架,编码226个氨基酸(GenBank登录号：AY 185207)。BLAST检索发现其氨基酸序列与烟草一个新的病程相关蛋白基因NtPRp27具有90％的同源性,在马铃薯中尚未发现与之同源的已知基因。Northern杂交结果表明,水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、机械伤害和渗透胁迫都能诱导该基因表达。该基因可能是马铃薯一个新的病程相关蛋白基因。     

铁皮石斛蔗糖磷酸合成酶基因的克隆与原核表达

应用同源序列克隆法克隆了铁皮石斛蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因cDNA全长,并进行了原核表达分析,为进一步研究该基因的时空表达、功能分析及多糖合成机理提供理论依据。结果表明:(1)铁皮石斛SPS基因cDNA全长3 502bp,编码区3 186bp,GenBank登录号JF423929。该基因编码1 061个氨基酸,与文心兰的SPS基因氨基酸序列的一致性最高为93%,与其他科植物SPS基因的氨基酸序列的一致性均高于60%。(2)原核诱导表达结果显示,SPS基因在大肠杆菌中的重组蛋白分子质量约为118.7kD,其表达与序列分析推测的结论一致。(3)生物信息学分析表明,铁皮石斛SPS基因的二级结构包括了螺旋、β-折叠和无规则卷曲,是非跨膜结构的亲水性不稳定蛋白,有2个功能结构域,分别是蔗糖合成功能域及糖基转移功能域。     

大黄鱼Flotillin-1基因分子特征分析

浮舰蛋白-1(Flotillin-1)是属于SPFH家族的蛋白,是重要的脂筏标志性蛋白.在构建大黄鱼(Larimichthys crocea)肌肉组织cDNA文库的基础上,克隆了Flotillin-1基因,并进一步扩增出内含子.克隆到的序列全长为2497 bp,其中编码区1194 bp,编码397个氨基酸.生物信息学分析大黄鱼Flotillin-1有5类20个功能位点,存在2次跨膜结构,N端和C端都位于细胞膜内.大黄鱼Flotillin-1氨基酸序列具有非常高的保守性,与大西洋鲑和斑马鱼的同源性都在80%以上.在组织中的表达也非常广泛,其中在脾中的表达最强.     

小麦γ-TMT基因的克隆与表达分析

γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E合成途径的关键酶之一。该研究采用RT-PCR方法,从小麦品种‘中国春’中克隆得到小麦γ-TMT基因的3个同源拷贝,其CDs(codingsequence)序列相似性为99.12%;其中Ta-γ-TMT-6A和Ta-γ-TMT-6B编码区长度为1101bp,编码366个氨基酸,而Ta-γ-TMT-6D因发生无义突变,编码365个氨基酸。生物信息学分析表明,3个蛋白分子量分别为39.58、39.53和39.50kDa,理论等电点分别为6.67、6.41和7.08,都属于亲水性不稳定非分泌型蛋白。系统进化分析表明,小麦Ta-γ-TMT蛋白与糜子Pm-γ-TMT的亲缘关系相对较近。实时定量PCR分析表明,小麦Ta-γ-TMT基因在根、茎、叶、颖壳、种子中均有表达,在叶片中表达量最高;ABA、NaCl、PEG均能诱导Ta-γ-TMT基因的上调表达。该研究结果为进一步探讨小麦γ-TMT基因的功能奠定了基础。     

基因编辑技术的发展及其在农业生产中的应用

对动植物和人类基因组的测序为功能基因组研究提供了基础数据。然而,核苷酸序列信息并不足以帮助我们了解特定的基因组元件的功能及其在表型形成中的作用。基因编辑技术能够在很大程度上解决这一问题,帮助人们快速获得新的基因组突变模式,从而以更便捷高效的方式进行功能基因组研究。对基因编辑的基本原理及常见的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)和2013年出现的CRISPR/Cas9系统进行了回顾,讨论了基因编辑技术的应用历史,特别在农业应用方面,重点关注了CRISPR/Cas9系统在水稻基因编辑中的应用,阐述了CRISPR/Cas9在基因组编辑领域的问题和其他应用方面的困难,探讨了基因编辑工具在作物改良方面所面临的主要挑战和未来发展趋势。     

基于线粒体COⅠ、Cytb和COⅡ基因的中国草地螟不同地理种群遗传分化分析

【目的】揭示中国草地螟Loxostege sticticalis不同地理种群的遗传分化程度。【方法】采用PCR技术扩增中国西北和华北地区草地螟11个地理种群的线粒体COⅠ,Cytb和COⅡ基因序列,基于其序列变异及单倍型贝叶斯系统发育树和单倍型网络图分析,探讨不同地理种群间的遗传距离、分子系统发生关系及遗传分化程度。【结果】草地螟11个地理种群的线粒体COⅠ,Cytb和COⅡ基因序列分别有24, 12和69个变异位点(分别占总序列的3.6%, 2.7%和8.8%),检测到的单倍型分别为22, 14和16个,单倍型多样度(Hd)分别为0.7600, 0.5842和0.7341,核苷酸平均差异度(K)分别为1.704, 0.752和3.997,不同单倍型间的遗传距离平均值分别为0.004, 0.005和0.013。总种群的Tajima’s D和Fu’s Fs值皆不显著,表明草地螟不同地理种群间的遗传分化不明显,群体大小稳定。根据各地理种群的单倍型建立的系统发育树和单倍型网络图表明,各单倍型散布在不同的地理种群中,无明显的地理分布格局。【结论】草地螟各地理种群的遗传距离与地理距离间不具有显著的相关性,其遗传分化不明显。     

Rho/ROCK信号通路与神经可塑性

在神经网络中,神经可塑性是大脑响应内在和外在刺激的重要特征。越来越多的研究已经阐明了神经可塑性与神经损伤性疾病之间的相关性。Rho/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho/Rho associ-ated coiledcoil forming protein kinase, Rho/ROCK)通路是生物体广泛存在的经典信号通路,参与细胞迁移、树突发育和轴突延伸,并且与帕金森、精神发育迟滞和阿尔茨海默症等多种神经退行性或损伤性疾病有关。本文对Rho/ROCK信号通路与神经可塑性的研究进展予以综述,讨论了ROCK抑制剂对各种神经疾病的潜在治疗前景。     

三种组成型启动子调控的鼠李糖脂基因在防御假单胞菌中的异源表达及活性研究

本研究利用Red/ETDNA重组技术对实验室已有的含鼠李糖基转移酶基因RhlAB的分泌表达载体pBBR1-genta-RhlAB进行修饰,将3种不同强度组成型启动子(Papra、Ptac和PrhaB)成功替换了RhlAB基因在铜绿假单胞菌中的原始启动子,成功获得了表达载体pBBR1-genta-Papra-RhlAB,pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB,并将这些表达载体分别在防御假单胞菌Pf-5中异源表达,通过LB培养基发酵42h后,Pf-5/pBBR1-genta-RhlAB的鼠李糖脂产量为17.56mg/L,而Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB分别是11.135mg/L,441.135mg/L,557.764mg/L,启动子优化后产量分别是原始启动子的0.63,25.12和31.76倍。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的4类质核比不同的鼠李糖脂同系物。并通过实时荧光定量PCR检测RhlAB基因的表达量,发现启动子替换为Ptac和PrhaB后RhlAB基因表达量分别是原始启动子的2.16和2.77倍。本研究初步实现了RhlAB基因在Pf-5中的表达,发现组成型启动子Ptac和PrhaB比RhlAB的原始启动子表达效率更高,可为异源合成鼠李糖脂提供重要参考。     

农林类院校《细胞生物学》教学中植物类案例的应用

当前《细胞生物学》教材的主要内容来自于对酵母和动物的研究结果,而普通农林类院校生物学相关专业的教学内容以认识植物的生命活动规律为核心,讲授的具体内容与学生的专业联系并不密切。为弥补这种不足,我们在教学活动中特意将植物中细胞生物学相关研究的结论和最新研究进展融入到教学中,将细胞生物学的教学内容与专业特点紧密结合,激发学生的学习兴趣,提高教学效果。     

Smad2/3a对斑马鱼神经嵴细胞标记基因crestin表达的影响

目的 探讨Smad2/3a对脊椎动物神经嵴细胞发育的影响。方法 通过在斑马鱼胚胎单细胞时期显微注射smad2/3吗啉环修饰的反义寡核苷酸的方法,特异性敲降smad2/3基因的表达,至胚胎发育至6体节,利用整胚原位杂交检测神经嵴细胞特异性标记基因snail1b,sox10,foxd3和crestin的表达情况;通过casmad2 mRNA和smad3a mRNA显微注射的方法过表达smad2和smad3a,同样利用整胚原位杂交检测神经嵴细胞特异性标记基因crestin的表达情况;通过过表达casmad2及smad3a对下调smad2和smad3a的胚胎进行挽救。结果 smad2/3a被敲低后,crestin的表达量显著降低,而snail1b,sox10和foxd3的表达量无明显变化。smad3b被敲低后,crestin,snail1b,sox10和foxd3的表达量均无明显变化;过表达casmad2和smad3a均可导致crestin的表达量增高;过表达casmad2和smad3a可挽救由于smad2/3a敲降所造成crestin的低表达量。结论 Smad2和Smad3a对神经嵴细胞标记基因crestin的表达具有重要作用。     

利用CRISPR/Cas9技术构建流感病毒高产细胞系MDCK-Tpl2-/-

Tpl2是调节I型(IFNα/β)和II型(IFNγ) IFN的关键调控因子,对病毒感染期间产生有效免疫应答至关重要。为了建立支持流感病毒高效繁殖的新型MDCK细胞系,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tpl2基因敲除的MDCK细胞,绘制其细胞生长曲线;根据《中国药典》第三部,对细胞进行形态检查、内外源因子和致瘤性检测;流感病毒接种细胞(MOI=0. 1),测定12h、24h、48h、72h细胞培养上清的血凝滴度及72h TCID50滴度。结果:靶基因组测序结果显示,获得一株稳定敲除Tpl2的MDCK细胞(MDCK-Tpl2^-/-);其与亲本细胞生长速率无显著差异,均为贴壁、上皮样细胞形态;细胞内细菌、真菌、支原体、病毒及致瘤性检测均为阴性;病毒接种后12h、24h、48h、72h,MDCK-Tpl2^-/-细胞培养上清的血凝效价提高了1. 78～2. 5倍。病毒接种后72h,MDCK-Tpl2^-/-细胞培养上清病毒的TCID50滴度提高了2. 8倍。结果表明,利用Tpl2缺陷型MDCK细胞系可以提高流感病毒产量,为提升疫苗质量奠定基础。