Cre／lox介导剔除转双价抗虫sck＋cryIAc基因籼稻恢复系明恢86材料的选择标记基因

Cre/lox系统通过其Cre重组酶对lox序列进行切割和重新连接,介导lox序列发生特异性重组。利用重组报告基因系统Pactin-lox-hpt-lox-gusA,对Cre/lox系统在水稻(Oryza　sativa　L.)中介导转基因的剔除进行了研究。Pactin-lox-hpt-lox-gusA系统中选择标记hpt基因侧翼含两个同向lox位点,并位于水稻actin1启动子和gusA基因之间。当hpt在Cre酶作用下被剔除时,actin1启动子可以和gusA基因融合在一起从而驱动GUS表达。通过农杆菌介导获得了分别转cre基因、Pactin-lox-hpt-lox-gusA结构和双价抗虫基因lox-hpt-lox-sck-cryIAc结构的水稻。利用有性杂交方法将cre基因导入到转化lox结构的植株中。在4个转Pactin-lox-hpt-lox-gusA　T0植株×转cre　T0植株所配组合的30个杂交F1植株中,12个植株表达GUS活性,9个表现潮霉素敏感,表明hpt基因被剔除。研究进一步通过Cre/lox介导剔除转双价抗虫sck　 cryIAc基因籼稻恢复系明恢86材料基因组中的选择标记hpt基因。在9个转lox-hpt-lox-sck-cryIAc　T2代纯合植株×转creT2代纯合植株所配组合的77个杂交F1植株中,　56个植株表现潮霉素敏感。分子分析证实在这些对潮霉素敏感的植株中hpt基因已经被剔除。     

核基质结合区在转基因烟草中对转基因表达的影响

为研究核基质结合区 (matrixattachmentregions,MARs)在转基因植物中对外源转基因 (transgene)表达的影响 ,将来源豌豆 (PisumsativumL .)的MARs序列构建在报告基因 β_葡糖醛酸酶 (β_glucuronidase ,GUS)基因 (uidA)的两侧形成植物表达载体。将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体经根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens(SmithetTownsend)Conn)介导转化烟草 (NicotianatabacumL .)。GUS活性检测表明 ,MARs可以提高外源uidA基因的表达水平。和不包含MARs的转化植株相比 ,MARs序列的存在可以使uidA基因的平均表达水平提高 2倍 ,最高的可达 5倍     

通过细胞内的靶向定位大幅度提高外源蛋白在转基因植株的积累水平

通过体外操作,对豇豆胰蛋白酶抑制剂(cpti)基因进行修饰,获得了一个融合蛋白基因(sck)。该基因是在cpti基因的基础上,在其5’端添加了信号肽编码序列,在3’端添加了内质网滞留信号编码序列,旨在引导基因转译产物进入细胞内质网,并最终滞留在内质网及其衍生的蛋白体内。用sck基因转化烟草(Nicotiana tabacum L.),对获得的转基因植株进行ELISA检测。结果表明,含有修饰基因的转基因烟草CpTI蛋白含量有明显提高,比转末修饰cpti基因烟草平均高出2倍,最高单株可达4倍以上,同时转基因植株的抗虫性也有了显著的提高。结果表明,采用外源蛋白靶向定位的策略,可大幅度提高外源蛋白在转基因植物细胞内的积累量,在植物基因工程研究中具有广泛的借鉴意义。     

水稻EPSP合酶第一内含子增强外源基因的表达

分离并克隆了水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的第一内含子(EPI). 序列分析表明, EPI长704 bp, GC含量为36.2%. 为进一步研究EPI序列在转基因植物中对外源基因表达水平的影响, 将EPI序列插入CaMV35S启动子和报导基因β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase, GUS)基因(gus)之间. 采用基因枪法转化烟草叶片, gus基因瞬时表达表明, EPI序列的存在可以使GUS的表达水平提高. 利用农杆菌法转化烟草, 获得了gus基因稳定表达的植株. GUS活性检测表明EPI内含子的存在可以显著提高GUS基因的表达(P<0.01). Northern blot 分析表明, 在转录水平上gus基因在含EPI内含子的转基因植株中的表达高于不含EPI gus基因的表达, 并且成熟的gus mRNA中EPI被正确剪取掉了, 表明是一种非转译的内含子. GUS定量检测表明, EPI存在可以使GUS的平均表达水平提高3倍, 最高单株可提高6倍.     

CpTI蛋白在大肠杆菌中的高效融合表达及其纯化与活性测定

豇豆胰蛋白酶抑制剂 (Cowpea Trypsin Inhibitor) 基因 (CpTI) 因其抗虫谱广及不易耐受等优点在植物基因工程中得到广泛应用。为进行遗传修饰食品（Genetically modified foods, GMF）中所含CpTI基因表达产物的安全性评价,我们需要在体外微生物体系中获得大量的CpTI蛋白。采用pGEX融合蛋白表达系统,将CpTI与GST的编码序列在大肠杆菌BL21中进行融合表达,表达产物达到菌体总蛋白的40%。经一步Glutathione Sephrose 4B亲和纯化,融合蛋白GSTCpTI纯度达到90％以上。将Thrombin蛋白酶与融合蛋白过夜作用,可获得切掉了GST标签的CpTI蛋白。活性测定显示GSTCpTI及CpTI蛋白均具有明显的胰蛋白酶抑制剂活性。用纯化的融合蛋白免疫家兔还可诱导产生高效价的抗体,经ELISA检测抗体滴度>1∶20000。Western Blotting 实验显示,无论是菌体超声裂解后总蛋白中的CpTI蛋白或是经纯化后的CpTI蛋白均可与自制的抗体发生特异性结合。这为进一步进行CpTI蛋白的安全性评价工作奠定了良好基础。     

修饰的cry1Ac基因导入籼稻明恢81获得抗虫纯合系

采用细胞内定位技术对cryl Ac基因进行修饰,其表达产物定位于内质网及衍生自内质网的蛋白体。通过基因枪法成功地通过修饰的cryl Ac基因导入到优良杂交籼稻有恢81中。对潮霉素抗性植株的PCR和Southern检测及ELISA分析证实,修饰的cryl Ac基因已整合到受体水稻品种中并得以表达,自交加代结合潮霉素筛选于T2代获得转基因纯合系。抗虫性测试表明,部分转基因纯合系高抗二化螟(Chilo suppressalis)。     

棉铃虫幼虫中肠类胰蛋白酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据昆虫类胰蛋白酶序列的保守性设计了一对引物,以棉铃虫（Helicoverpa armigera)幼虫中肠总RNA反转录出cDNA第一链作为模板,利用RT－PCR,分离出了一种棉铃虫类胰蛋白酶（HaT)基因的cDNA序列。分析表明该cDNA序列的开放阅读框为696bp,编码一个由231个氨基酸残基组成的多肽,推测的氨基酸序列具有His57,Asp102,Ser192组成的电荷中继网,决定胰蛋白酶底物专一性的Asp189,底物结合部位的Gly216和Gly226残基,及其它胰蛋白酶结构上的保守区域。氨基酸序列同源性比较表明：HaT同其它鳞翅目昆虫类胰蛋白酶有较高的同源性,同源性在44％－79％之间。为研究棉铃虫类胰蛋白酶基因（hat)编码产物的活性,将其插入原核表达载体pGEX4T-3和pET23b中,并在大肠杆菌中进行了诱导表达,结果表明,GST－HaT融合蛋白在大肠杆菌中进行了特异表达,非融合形式的表达产物HaT具有胰蛋白酶催化活性。     

转修饰cry1Ac基因籼稻明恢81经花药培养获得抗虫DH系

对基因枪法获得的明恢81转修饰的cry1Ac基因当代植株进行花药培养,共接种花药2600枚,获得83份花培植株,其中双倍体植株43份,单倍体植株40份,PCR结果表明含有cry1Ac基因的植株55份,花培植株群体中转基因与非转基因植株的比值为2：1（55／28）,进一步结合Southern blot和ELISA分析,于花培植株当代筛选到转基因纯合株系36份,外源蛋白表达量上,花药来源于同一克隆的DH系的不同植株之间基本一致,最高的Cry1Ac含量达0．25％,田间抗虫性试验表明,经花药培养纯合获得的部分转基因纯合系植株对二化螟（chilo suppressalis)表现出高抗,而且主要农艺性状保持不变,以上结果表明水稻花药培养可以加速转基因的纯合与良种利用。