紫苏DGAT1基因克隆及四尾栅藻表达载体构建

利用RNAiso Plus试剂盒提取紫苏总RNA,以其为模板采用RT-PCR方法扩增出紫苏DGAT1基因的cDNA编码区序列并构建克隆载体pMD-DGAT1,再将克隆载体pMD-DGAT1和pBI121空载体进行Xba I和BamH I双酶切,连接目的片段构建表达载体pBI121-DGAT1。结果显示,克隆得到目的片段长度为1 657 bp,与GenBank中紫苏DGAT1基因序列的最大同源性为97%,所构建表达载体pBI121-DGAT1双酶切得到的两条片段长度与连接前一致。结果表明,成功转化四尾栅藻并得到表达,转化后四尾栅藻的油脂含量较转化前提高近1倍。     

纤维素乙醇工程化探讨

出于对能源安全、大气污染的担忧以及促进农村经济发展的考虑,世界许多国家使用乙醇作为含氧添加剂或交通运输燃料来替代汽油。纤维素乙醇生产原料丰富,且具有明显的低碳排放特性而备受关注。随着全球范围内几套大型纤维素乙醇示范装置的相继试车,工程化问题将得到解决,并有望在2015-2016年完成装置的经济性考核,逐步进入商业化阶段。为避免原料"与人争粮,与粮争地",1代燃料乙醇将逐步向2代纤维素乙醇过渡。本文在综述近期国内外纤维素乙醇产业化概况的基础上,从化学工程和生物工程的角度对预处理、酶制剂及酶解工艺、戊糖/己糖共发酵菌株及工艺、装备等几个方面的技术进展进行剖析,讨论了工程化遇到的主要问题,探讨了我国纤维素乙醇技术的发展方向。     

尿蛋白膜保存法与直接冻存法的成本效益分析

为了比较尿液蛋白PVDF膜富集保存法(尿膜)和尿液直接冻存法两种方法的优缺点。通过比较两种方法在时间、所占空间、费用、蛋白降解程度及大样本临床实践性方面的区别。发现在所占空间、电费方面及临床实践性方面尿膜保存法优于直接冻存法,而在时间及耗材花费方面直接冻存法优于尿膜保存法。因此尿蛋白的尿膜保存法比直接冻存法有更强的实际应用价值。     

草地物种多样性对群落可入侵性影响的研究进展

综述草地群落入侵实验中物种多样性和群落可入侵性关系的研究进展。目前物种多样性与群落可入侵性主要出现了对立的关系模式,被普遍接受的解释机制为尺度依赖。但其它研究中出现了更为复杂的关系,提出物种特性、植物更新、种间关系变化和群落构建机制等其它因素可能是导致物种多样性与群落可入侵性出现复杂关系的原因。建议未来研究中应注意的几个问题,即物种多样性与群落可入侵性关系在不同营养级适用性,与群落构建机制变化间的联系和时间尺度对物种多样性与群落可入侵性关系的影响。     

公立医院药事服务费收取标准的测算与敏感性分析

通过文献综述对药事服务费的相关概念进行了梳理。在此基础上,利用上海市宝山区5家综合性医院的财务会计报表和调查统计表数据,分别测算了弥补药品加成收入和弥补药事服务成本两种不同思路下的药事服务费,并对不同财政投入和医疗服务价格政策下的药事服务费收取标准进行了敏感性分析,为政府科学决策提供了理论依据。研究认为,取消药品加成、收取药事服务费是医改深入推进的必然趋势,药事服务费在不同经济发展程度的地区可有不同收费标准,但均要建立定期调整机制。     

甘蓝型特高含油量油菜种质资源及主栽品种指纹图谱构建

本研究选择特高含油量资源7份,与中国各油菜主产区具有代表性的主栽品种16份,利用SSR多引物组合法开展指纹图谱构建研究。选择多态丰富、图谱清晰稳定且来自不同连锁群的引物28对,对所有材料进行指纹图谱分析,共获SSR指纹条带302条,其中多态性条带为279条,每引物所获条带6-16条,平均10.79条,平均多态率92. 38%,通过指纹图谱将所有材料有效地区别开来。用非加权类平均法（UPGAM）聚类分析显示：高油材料之间以及高油材料与主栽品种之间遗传距离均有较大差异,在遗传距离0.171处可将23份材料分成9个类群,其中7份高油材料分处4个类群,遗传距离差异显著;而其他8份主栽品种被分别聚类在另外5个类群中;所有材料间皆具有丰富的遗传多样性,其中高油材料与主栽品种间遗传差异更大。     

小鼠DLL1真核表达载体的构建及其在肿瘤细胞中的表达

目的:构建带绿色荧光蛋白的小鼠DLL1全长基因真核表达载体,并在肿瘤细胞中表达。方法:利用PCR特异性引物扩增出DLL1基因全长,将克隆的基因片段插入带绿色荧光蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP质粒中。然后利用脂质体将重组质粒pIRES2-EGFP-DLL1转染进小鼠B16黑色素瘤细胞中,并通过G418筛选后选取生长良好、荧光强度高的三株单克隆进行mRNA水平DLL1表达的鉴定。结果:成功扩增小鼠DLL1的全长基因。克隆入质粒载体后,通过DNA序列测定证实其序列正确。将构建的pIRES2-EGFP-DLL1质粒转染小鼠B16黑色素瘤细胞,经过G418筛选和荧光显微镜观察后,挑选得到GFP阳性率90%以上的稳定转染细胞株。RT-PCR检测稳定转染细胞的mDLL1的表达显著增加,进一步证实了pIRES2-EGFP-DLL1的表达效能。结论:成功构建了小鼠DLL1基因的真核表达质粒,证实其在真核细胞B16中可以表达。     

心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的CREG 蛋白表达载体 的构建及鉴定

目的:构建心肌特异性α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)启动子启动E1A基因阻遏子(cellular repressorof E1A-stimulated genes,CREG)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合的真核表达载体。绿色荧光蛋白作为报告基因,方便在心肌细胞中直接观察CREG蛋白的表达,为心肌特异性转CREG基因动物模型制备提供载体。方法:用BamH I和EcoR I双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1中,构建pCREG-EGFP-N1;根据Genebank中公布的α-MHC基因的启动子序列,人工合成pUC57-α-MHC启动子基因序列,经Ase I和Nhe I双酶切得到启动子α-MHC,亚克隆入pCREG-EGFP-N1中替代原CMV启动子,构建pα-MHC-CREG-EGFP-N1,测序鉴定。用脂质体法将该质粒转染体外培养的小鼠原代心肌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。结果:成功构建pα-MHC-CREG-EGFP-N1质粒,酶切及测序结果正确;成功转染入原代培养小鼠心肌细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。结论:重组质粒pα-MHC-CREG-EGFP-N1体外转染入原代培养小鼠心肌细胞后,目的基因能够在心肌细胞中有效表达,检测方法简便可靠,为下一步建立心肌细胞特异性表达CREG的过表达转基因小鼠、深入探讨CREG在心肌疾病发生中的生物学功能研究奠定了基础。     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

牛肠激酶催化亚基工程菌的构建

目的：构建牛肠激酶催化亚基工程菌。方法：将带有牛肠激酶催化亚基（bEKL）的结构基因进行克隆,将克隆产物纯化后,构建bEKL克隆质粒,后构建bEKL表达质粒,并将表达质粒制导入备感受态细胞,进行蛋白表达。结果：琼脂糖电泳验证牛肠激酶催化亚基基因已经成功地插入表达载体,序列与预期设计一致。结论：表达质粒构建成功。