具有重要应用价值的真核表达系统

基于Ｔ７ＲＮＡ聚合酶与Ｔ７强启动子（１０）间的特异识别而建立起来的偶联表达系统在大肠杆菌中已取得了令人满意的结果。最近,该系统在酵母、昆虫、哺乳动物细胞和植物细胞中陆续实现了高效表达。Ｔ７ＲＮＡ聚合酶－１０启动子偶联表达系统的相对独立性和高效性,不仅预示着该系统可以在真核基因工程中发挥重要作用,而且其独特的作用机制为人们探索新的特异高效真核表达系统提供了一个可供借鉴的模式 。     

Cre/lox介导剔除转双价抗虫sck+cryIAc基因籼稻恢复系明恢86材料的选择标记基因

Cre/lox系统通过其Cre重组酶对lox序列进行切割和重新连接,介导lox序列发生特异性重组.利用重组报告基因系统Pactin-lox-hpt-lox-gusA,对Cre/lox系统在水稻(Oryzasativa L.)中介导转基因的剔除进行了研究.Pactin-lox-hpt-lox-gusA系统中选择标记hpt基因侧翼含两个同向lox位点,并位于水稻actinl启动子和gusA基因之间.当hpt在Cre酶作用下被剔除时,actinl启动子可以和gusA基因融合在一起从而驱动GUS表达.通过农杆菌介导获得了分别转cre基因、Pactin-lox-hpt-lox-gusA结构和双价抗虫基因lox-hpt-lox-sck-cryIAc结构的水稻.利用有性杂交方法将cre基因导入到转化lox结构的植株中.在4个转Pactin-lox-hpt-lox-gusA T0植株×转cre T0植株所配组合的30个杂交F1植株中,12个植株表达GUS活性,9个表现潮霉素敏感,表明hpt基因被剔除.研究进一步通过Cre/lox介导剔除转双价抗虫sck cryIAc基因籼稻恢复系明恢86材料基因组中的选择标记hpt基因.在9个转lox-hpt-lox-sck-cryIAcT2代纯合植株×转creT2代纯合植株所配组合的77个杂交F1植株中,56个植株表现潮霉素敏感.分子分析证实在这些对潮霉素敏感的植株中hpt基因已经被剔除.     

病毒诱导的PVX cp转基因沉默及其DNA甲基化

利用PCR方法获得了马铃薯X病毒(PVX)外壳蛋白(CP)基因(cp),并将其构建到植物表达载体中,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.).Northern杂交及Run on实验表明有3株转基因烟草发生了转录后基因沉默.发生沉默的cp基因的甲基化分析结果表明,发生转录后基因沉默的cp基因发生了不同程度的甲基化,说明DNA甲基化并没有完全抑制cp基因的转录.利用PVX病毒对外壳蛋白正常表达的转基因烟草进行接毒,Northern杂交检测结果表明,病毒诱导cp发生了基因沉默.进一步的Run on结果表明,转基因烟草中cp基因在沉默前后转录速率并没有发生变化,说明病毒诱导的沉默是一种转录后沉默.对cp基因沉默前后的甲基化分析表明,病毒的侵染导致了cp基因甲基化程度的增加.     

Cre／lox介导剔除转双价抗虫sck＋cryIAc基因籼稻恢复系明恢86材料的选择标记基因

Cre/lox系统通过其Cre重组酶对lox序列进行切割和重新连接,介导lox序列发生特异性重组。利用重组报告基因系统Pactin-lox-hpt-lox-gusA,对Cre/lox系统在水稻(Oryza　sativa　L.)中介导转基因的剔除进行了研究。Pactin-lox-hpt-lox-gusA系统中选择标记hpt基因侧翼含两个同向lox位点,并位于水稻actin1启动子和gusA基因之间。当hpt在Cre酶作用下被剔除时,actin1启动子可以和gusA基因融合在一起从而驱动GUS表达。通过农杆菌介导获得了分别转cre基因、Pactin-lox-hpt-lox-gusA结构和双价抗虫基因lox-hpt-lox-sck-cryIAc结构的水稻。利用有性杂交方法将cre基因导入到转化lox结构的植株中。在4个转Pactin-lox-hpt-lox-gusA　T0植株×转cre　T0植株所配组合的30个杂交F1植株中,12个植株表达GUS活性,9个表现潮霉素敏感,表明hpt基因被剔除。研究进一步通过Cre/lox介导剔除转双价抗虫sck　 cryIAc基因籼稻恢复系明恢86材料基因组中的选择标记hpt基因。在9个转lox-hpt-lox-sck-cryIAc　T2代纯合植株×转creT2代纯合植株所配组合的77个杂交F1植株中,　56个植株表现潮霉素敏感。分子分析证实在这些对潮霉素敏感的植株中hpt基因已经被剔除。     

水稻转基因研究及新品种选育

水稻是最重要的粮食作物之一,世界上约有一半以上的人口以稻米为主食.我国水稻每年播种面积在4.2亿～4.5亿亩(1亩=0.067公顷,下同)之间,占粮食总产量的38%、食粮的70%,在粮食生产中占有举足轻重的地位.随着人口的增长和耕地面积的减少,我国将面临粮食问题的严峻挑战.     

外源超氧化物歧化酶基因MnSOD在玉米中的过量表达及抗逆性的提高

为研究过量表达的超氧化物歧化酶基因MnSOD对玉米抗逆性的作用,构建了小麦来源MnSOD基因的单子叶植物高效表达载体,用基因枪法转化优良玉米自交系胚性愈伤组织。经潮霉素梯度浓度培养基筛选,从阳性愈伤组织再生获得9个正常结实的植株。其中5株经PCR和Southern印迹检测表现为阳性,表明外源基因己整合到玉米基因组中。提取SOD酶液,非变性聚肉烯酰胺浓度梯度凝胶电泳分离,用H2O2 5mmol／L抑制FeSOD和CU／ZnSOD活性,氯化硝基四氮唑蓝染色检测MnSOD酶活性。Southern印迹呈阳性的5个植株,MnSOD酶活性均高于未转基因的对照。甲基紫精氧化损伤处理后,用电解质渗漏率法测定阳性株系的叶片渗透液的电导率。结果表明,转基因株系的抗氧化损伤能力显著高于对照。     

棉花曲叶病毒大基因间区启动子在宿主植物中的表达活性

棉花曲叶病毒(CLCuV)是一种单链DNA病毒,属于双生病毒亚组Ⅲ.为了研究其基因组大基因间区(LIR)的功能,以CLCuV侵染的烟草叶片组织总DNA为模板,通过聚合酶链反应扩增LIR并插入克隆载体.将LIR分别以互补链及病毒链基因转录方向与gus报告基因和nos终止子融合,构建了植物表达载体.通过农杆菌介导的方法转化烟草并测定转化植株的GUS活性,实验结果表明,LIR在互补链基因方向具有强启动子活性,GUS平均活性是CaMV 35S启动子的5～6倍,单株最高的GUS活性达到CaMV 35S启动子的10倍;组织化学定位证实其在叶肉及维管组织均有活性.LIR在病毒链基因方向的启动子活性较低.报道了CLCuV来源的分离的LIR在互补链基因方向可作为一种新型的强启动子元件应用于植物遗传操作.