应用噬菌体随机肽库技术筛选丙肝病毒NS3抗原模拟表位

以抗 HCVNS3的单克隆抗体作为固相筛选分子 ,对人工合成的噬菌体随机 12肽库进行 5轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选过程 ,随机挑取 4 2个克隆 ,经噬菌体酶联免疫吸附法 (ELISA)鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验 ,最后对所选克隆进行DNA序列分析 ,以确定HCVNS3抗原的模拟表位。经噬菌体富集后 ,从随机筛选的 4 2个克隆中得到 11个阳性克隆 ,确定氨基酸序列XXIXXXXMSNXX为HCVNS3的模拟表位。我们用噬菌体12肽库成功筛选得到HCVNS3的模拟表位 ,为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件     

链霉菌基因转移的方法

本文介绍了用于链霉菌基因转移的各种方法,涉及原生质体转化,电穿孔,接合转移和噬菌体转导,对影响链霉菌基因转移的各种因素进行了分析。     

霍乱弧菌VPIФ/CTXФ/TCP体系:噬菌体-噬菌体-细菌多元作用

霍乱由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)菌株感染人体所引起,可导致重度脱水性腹泻,死亡率高.霍乱弧菌存在于水生环境中,人类因食用被污染的水或食物而受到感染,暴发流行.VPIФ/CTXФ/TCP体系是决定该菌侵染力和毒力的关键,它集中体现了有关噬菌体——噬菌体——宿主细菌多元作用,阐释其分子机制是目前十分活跃的研究领域[1,2].作为典型示例,这个体系突出了噬菌体介导的病原细菌毒力溶源转变、毒力基因水平转移和进化等同题[3],开创了在分子水平上研究流行病学、预防医学的新领域[4-6].     

噬菌体治疗中细菌对噬菌体的抗性

抗生素治疗尽管有几十年有效治疗的历史,但随着越来越多耐/抗药性细菌的出现,细菌对抗生素的抗药性已成为一个大问题。噬菌体治疗是使用噬菌体作为抗菌剂来感染细菌株系,它一直是人们倡导的一个很有前途的常规抗生素治疗的替代方案。然而,由于细菌与噬菌体的协同进化中,细菌可以通过多种机制获得对噬菌体的抗性。因此,人们对噬菌体治疗抱有期望的同时,也关注噬菌体治疗长时间的使用之后,是否会与抗生素使用之后结果相类似,导致抗性细菌病原菌感染的治疗困难。综述了细菌-噬菌体协同进化中细菌病原菌对有感染能力的噬菌体是否会产生抗性,及其在噬菌体治疗中影响的争论,并展望了噬菌体治疗的潜在前景。     

噬菌体展示抗克伦特罗抗体文库的构建及单克隆抗体的筛选

利用小白鼠免疫和噬菌体展示技术构建了噬菌体展示抗体文库,从文库中筛选获得了一株抗克伦特罗单克隆抗体。该抗体的氨基酸序列尚未在世界基因数据库中登录,是一个新的抗体。该抗体对于游离克伦特罗的半抑制率IC50为0.602μg/mL。该噬菌体展示的抗体片段可以用于竞争法检测克伦特罗的含量,其能够检测出的最低浓度为15.6 ng/mL,具有较大的实用价值。     

噬菌体展示技术在疫苗研究中的应用进展

噬菌体是一种以细菌为宿主的具有严格宿主特异性的病毒,近年来由于分子生物学和基因重组技术的长足发展,藉助噬菌体的基本特性创立和发展了噬菌体展示技术,此项技术将外源肽或蛋白与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面。利用这项技术制作的疫苗具有安全可靠、稳定性高、免疫效果好等优点,因此,在新型疫苗的研制上具有很大的应用价值。就噬菌体展示技术及其在疫苗研究中的优势、预防性疫苗与治疗性疫苗的研究进展予以综述。     

噬菌体gp17基因2种重组产物的抗菌效应比较

通过重组技术获得大肠埃希菌噬菌体内溶素纯化蛋白和表面展示噬菌体,并观察产物的生物效应。将肠侵袭性大肠埃希菌EIEC 8401噬菌体LSB-1内溶素基因gp17构建到质粒pET300中,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达,通过Ni柱纯化系统纯化产物;利用噬菌体展示技术构建T7-LSB-gp17重组噬菌体,通过双层琼脂法纯化噬菌体,并观察2种产物的抗菌效应。2 139 bp的gp17基因通过重组技术表达出78.3 ku的可溶性蛋白,纯化后浓度为2.38 mg/mL,其对EIEC8401有良好的抑菌活性,但对其他试验菌无抗性;通过噬菌体展示技术构建的重组噬菌体T7-LSB-gp17通过SDS-PAGE电泳显示在78 ku处有表达增强,对EIEC8401无感染、裂解作用,但对EIEC8401及其他试验菌有明显溶菌作用,宿主谱增加。通过重组技术获得的噬菌体LSB-1内溶素基因gp17的产物对LSB-1噬菌体原宿主具有明显的抑制效应。其中gp17表达的纯化蛋白具有明显的宿主专一性,重组噬菌体悬液有较宽种类的抗菌作用。这可能是因为gp17蛋白与噬菌体表面复杂空间结构的相互作用产生的生物效应。     

ΦC31整合酶介导猪基因组定点修饰的探讨

高效与特异的基因组定点修饰是基因工程动物研究的前沿与难点.链霉菌噬菌体ΦC31整合酶能介导含attB位点的外源基因定点整合于多种真核生物基因组的假attP位点,可维持外源基因的正常结构及高效表达.本文探讨ΦC31整合酶介导外源基因在猪基因组内定点整合的分子基础.构建含attB位点的报告载体pEGFP-N1-attB,与ΦC31整合酶表达载体pCMV-INT共转染猪肾PK15细胞,G418筛选获得单克隆细胞系.实时荧光定量PCR筛选出单拷贝整合的转基因细胞系.TAIL-PCR鉴定出1个猪基因组假attP位点,位于猪1号染色体,watson链,坐标114220087-114220126,命名为pig-attP-1.测序结果显示,pEGFP-N1-attB在attB位点处断开插入到pig-attP-1.用荧光计测定细胞培养基上清EGFP含量发现,该转基因细胞系EGFP的表达水平是本底的50倍(13500 AU vs.280 AU),表明pig-attP-1是利于外源基因高效表达的"友好位点".该研究不仅为实现外源基因在猪基因组内的定点整合提供了新策略,也为创制基因工程猪、建立动物生物反应器等研究注入了新思路.     

Stx2噬菌体溶原对大肠杆菌运动性及其相关基因表达的影响

【目的】通过基因缺失和噬菌体溶原转换研究大肠杆菌运动相关基因flhDC、fliA、fliD和fliE对Stx2噬菌体ΦMin27溶原菌的影响。【方法】本实验利用Red重组酶系统,构建了大肠杆菌MG1655的缺失株MG1655△flhDC、MG1655△fliA、MG1655△fliD及MG1655△fliE,并将flhDC片段、fliA片段、fliD片段和fliE片段连接pUC18后分别转化相应的突变株,得到相应的互补菌株。通过Stx2噬菌体ΦMin27的感染获得各缺失株的溶原株MG1655△flhDCФMin27、MG1655△fliAФMin27、MG1655△fliDФMin27及MG1655△fliEФMin27。随后测定了野生株、缺失株、互补株和溶原株的运动能力,并通过荧光定量PCR分析了flhDC缺失前后野生株和溶原株其他运动相关基因表达量的变化。【结果】Stx2噬菌体ФMin27溶原感染可促进MG1655的fliA和fliD基因的表达,增强宿主菌MG1655的运动特性;MG1655在flhDC基因缺失的状态下,fliA和fliD基因的表达同步出现上调,但运动性未发生变化,而MG1655△flhDC溶原菌丧失了运动特性,基因转录水平检测发现MG1655△flhDCФMin27与MG1655△flhDC相比,fliA和fliD基因的表达同步出现显著下调,而对fliE基因的表达几乎没有影响。fliA、fliD和fliE单个基因的缺失对大肠杆菌MG1655和Stx2噬菌体ΦMin27溶原菌的运动性几乎没有影响。【结论】提示fliA和fliD基因共同参与了鞭毛运动的调控,flhDC基因可影响噬菌体溶原菌株的运动性,为进一步研究噬菌体溶原与宿主基因之间的相互调节作用提供理论依据。