伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段在Pichia pastoris中的表达

伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E是一种在伪狂犬病根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαA中,获得的重组表达载体pPICZαA-FL电击转化野生型酵母菌SMD1168后,得到多株酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL.经高浓度ZeocinTM筛选、表型鉴定、工程菌的诱导表达及表达产物的鉴定,最后得到高效表达gE基因去信号肽片段的酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL-7.工程菌72 h培养上清的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹结果显示,gE基因去信号肽片段表达产物大小约为80 ku,比预期的63.8 ku大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的13.49%,表达量可达11.7 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分伪狂犬病病毒gE标准阳性与阴性血清.     

金鱼PP2A-B′家族δ基因cDNA的克隆及表达分析

通过3′-RACE及5′-RACE技术克隆得到了金鱼蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase2A,PP2A）调节亚基B′家族δ（Delta）基因的cDNA全序列.结果显示,金鱼δ基因cDNA全长2415bp,编码一个含555个氨基酸的蛋白.序列分析表明,该基因编码的蛋白与已知其他物种对应的B′家族蛋白质均有着很高的同源性.RT-PCR分析证明,该基因mRNA表达水平在大脑中为最高,肝脏、精巢、卵巢、肾脏和鳃中次之,鳍中最少.在不同胚胎时期中,两细胞期、多细胞期、囊胚期和原肠胚期表达最高,其他时期相对较低.在蛋白水平上,精巢、卵巢、大脑和心脏中最高,肝脏中次之,肾脏、鳃和鳍中最少.在胚胎中,两细胞期、多细胞期、囊胚期、原肠胚期和神经胚期及视原基期表达最高,脑泡分化和眼色素期表达量最少.由此可以推测PP2AB′-δ基因在金鱼不同组织和胚胎发育的不同时期中可能起着多种重要作用.     

DLK1基因在急性白血病细胞系中的表达及其意义

目的:研究急性白血病细胞系DLK1基因的表达水平在红系分化中的作用.方法:采用RT-PCR、Western bitting时白血病细胞系K562、HL-60进行DLK1水平的检测.培养K562细胞,用氯化高铁血红素(hemin)诱导其分化,观察DLK1在红系分化中的变化.结果:K562细胞DLK1mRNA、蛋白水平存在明显表达,HL-60细胞DLK1则不表达.通过RT-PCR检测了hemin诱导K562细胞向红系分化过程中各时间点DLK1mRNA的变化,显示随着K562向红系分化,DLK1mRNA的水平逐渐下降.结论:K562细胞表达DLK1,HL-60不表达DLK1.DLK1基因可能参与K562细胞向红系分化的过程,可能抑制其分化.     

重组GIP蛋白的原核优化表达及其生物活性的研究

葡萄糖依赖性促胰岛素多肽或抑胃肽(glucose-dependentinsulinotropicpolypeptideorgastricinhibitorypeptide,GIP)是由42个氨基酸组成的胃肠调节肽,在高血糖背景下能够刺激胰岛素释放,能够抑制胃酸分泌、促进神经细胞增生,具有广泛的临床应用价值.化学提取或人工合成GIP,成本过高,不宜规模化生产,故应用基因工程技术研制重组人GIP(rhGIP)并探讨其生物活性有积极的现实意义.人工合成具有大肠杆菌偏爱密码子的编码GIP成熟肽的cDNA序列,利用pET32a( )系统进行原核表达;在小规模发酵条件下,进行优化诱导表达和目的蛋白的亲和纯化;通过检测SD大鼠胃酸分泌和血糖浓度,对纯化后的rhGIP进行生理活性研究;通过形态学观察和培养基中NO含量测定,检测rhGIP对PC12细胞NO自由基生成量的影响;应用Aβ25-35加入培养基造成PC12细胞神经损伤模型,分别以高、中、低剂量rhGIP作用于此模型,通过MTT(2-(4,5-dimethylthia-zol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)法测定PC12细胞的活性.结果显示,成功克隆了人GIP基因,诱导表达的rhGIP占细胞总蛋白质的35%,部分可溶,部分以包涵体形式存在.经过诱导表达的重组蛋白质分子质量约为26ku,与理论值相符.纯化后的rhGIP具有免疫活性.优化诱导表达条件为表达菌生长密度A600值0.50,IPTG浓度0.5mmol/L,温度37℃,诱导表达时间4h.裂解上清液经固定化金属亲和层析一步法层析后,表达的水溶性rhGIP融合蛋白的最后得率为1.2mg/L菌液,纯度为85%.纯化后的rhGIP能够使SD大鼠胃液pH值增高,其抑制胃酸分泌作用与生理盐水对照组比较差异有显著性(P<0.05),而rhGIP组和标准品GIP组比较差异无显著性.在高血糖背景下,注射rhGIP15min后,大鼠血浆血糖浓度较基础血糖显著降低(P<0.05),30min时与单独注射葡萄糖的模型对照组比较,差异无显著性,而rhGIP组和标准品GIP组其差异不显著.在rhGIP对神经细胞的营养和对PC12细胞免受神经损伤和缺氧损伤影响的研究中发现,用rhGIP培养PC12细胞32h后,rhGIP组NO含量极显著低于正常对照组(P<0.01),细胞存活较多,神经突起延伸较好,中、高剂量rhGIP组均较神经损伤和缺氧损伤组活性显著升高(P<0.05),且细胞活性呈剂量依赖关系,rhGIP组与标准品GIP组差异不显著,与正常对照组亦无显著差异.研究结果表明,已得到高效表达的rhGIP融合蛋白,该蛋白质具有免疫活性,具有抑制胃酸分泌和降低大鼠血浆血糖浓度的生理活性,并且对神经细胞有营养和保护作用.     

兔眼越桔(杜鹃花科)花粉形态——兼谈用极坐标测量四合体花粉的一种新方法

扫描电镜下,兔眼越桔花粉为四合体,外形为准四面体,中等大小,表面具不规则皱波状纹饰,并有多处凹陷。萌发孔沟多为3对(顶分体3条,侧分体各对应1条),以四面体几何中轴为中心,中心对称分布于四面体的3个侧面。萌发孔沟的长度、宽度、孔盖长与宽、孔盖的形状、突起的程度等,在个体间有差异,尤其是一些具有多处凹陷的花粉粒,可能是导致花粉萌发率不同的生态类型。用极坐标法描述四合体花粉的新方法可以表现其饱满度,比较传统上用极轴、赤道轴的长短表现花粉平面大小的方法,更加准确而直观。     

tRFs结构及其生物学功能

tRFs（tRNA-derived RNA fragments）是来源于tRNA的小分子非编码RNA,由前体tRNA或成熟tRNA经加工和修饰而成,在生物界中广泛存在。tRFs深度测序结果表明,tRFs可能并不是由tRNA随机裂解产生的,而是通过某个特定机制生成。根据来源不同,tRFs可被分为tRF-1、tRF-2、tRF-3、tRF-5和tiR。tRFs具有类似于miRNA的调控功能,并能参与调控基因转录和翻译,细胞增殖以及细胞应激反应。新近研究表明,乳腺癌细胞中某些特异性的tRFs（如tRF^GlyTCC和tRF^AspGTC）,可通过与Y-box结合蛋白1（Y box binding protein 1, YB-1）结合进而抑制癌细胞的生长和转移。另有研究表明,tRFs还可通过细胞色素c介导的信号转导途径来发挥其抑制癌细胞凋亡的功能。由此可见,tRFs在调控癌症发生发展过程中也具有重要调控作用,然而其机制仍不清楚。本文综述了tRFs结构和分布、生物学功能及其作用机制的研究现状,旨在为tRFs相关研究提供参考。     

中国和越南褐飞虱抗药性研究

2010年用稻茎浸渍法监测了我国和越南共14个褐飞虱Nilaparvata lugens(St(a)l)田间种群对5种杀虫剂的抗性,结果表明:14个褐飞虱田间种群对吡虫啉、噻嗪酮、氟虫腈、吡蚜酮和叶蝉散的LC50值分别在9.5287～46 6716、1.6621～17.8785、0.9818～ 8.4084、0.331...     

真菌对土壤N2O释放的贡献及其研究方法

N₂O是一种重要的温室气体,而土壤作为N₂O的重要来源之一,其N₂O主要产生于硝化和反硝化作用的生物过程.研究表明细菌和古菌是这些生物过程的主要参与者,然而在特定土壤生态系统中,真菌在N循环过程中起主要作用.但真菌对土壤N₂O释放贡献的研究报道甚少.本文阐述了土壤真菌N₂O产生机制的研究进展,介绍了自养硝化、异养硝化和反硝化过程的发生机理、关键微生物和功能基因.详细介绍了与真菌有关的N₂O产生过程,真菌的异养硝化作用和反硝化作用,并且比较了真菌和细菌反硝化系统的差异.此外,本文重点总结了研究土壤真菌N₂O产生的主要方法,包括选择抑制剂法、^15N标记、分离和纯培养以及免培养的分子生态学方法,对各种方法的优势和弊端进行了探讨,并对今后的研究工作提出了展望.     

解剖型锁定钢板治疗Pilon骨折的临床疗效分析

目的:探讨解剖型锁定钢板治疗Pilon骨折的临床疗效和安全性。方法:选择2009年1月~2012年12月采用解剖型锁定钢板内固定治疗30例Pilon骨折患者为研究对象,所有患者在无明显手术禁忌情况下,均行开放复位钢板内固定术。术后采用Mazur评分系统评价手术效果。结果:本组全部患者均获得随访,骨折平均愈合时间为4.1个月;参照Mazur踝关节功能评分系统:优14例,良13例,可2例,差1例,优良率90%。仅1例开放性Pilon骨折患者发生皮肤感染坏死,局部缺损,经清创、VSD覆盖负压吸引,待新鲜肉芽组织形成后,行带蒂皮瓣移植术,愈合良好。结论:解剖型锁定钢板的解剖形态好,成角稳定,用于治疗Pilon骨折能够恢复关节面的完整性、稳定性,减少并发症的发生,临床效果好,安全性高。     

阻生牙拔除术的临床进展

阻生牙是指由于各种阻力导致不能正常萌出的牙齿的统称,通常阻生牙牙体大部甚至全部埋伏于骨内。阻生牙可导致各种并发症的发生,因此临床上一般主张预防性拔除阻生牙。阻生牙拔除手术因其难度高、风险大、术后反应重一直是口腔牙槽外科关注的重点。近年来随着手术器械、手术观念等方面的进步,阻生牙拔除术取得了一些临床进展。新型CT扫描设备CBCT可以为手术设计提供精确定位;借助各类微创器械,微创拔牙技术减小了手术创伤,降低了手术风险;新型麻醉方式和新型局麻药物可以极大减轻疼痛反应;心理干预也将成为阻生牙拔除患者围手术期管理的重要步骤。本文对近年来阻生牙拔除术在定位方式、微创技术、团队协作、疼痛控制和心理干预等方面的临床进展做一综述。