小麦细胞增殖核抗原基因启动子的克隆及活性分析

细胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）基因是DNA聚合酶δ的辅助因子,在真核细胞DNA复制及其损伤修复中发挥着重要的作用.采用高效热不对称交互PCR法（high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR,hiTAIL PCR）从小麦西农1 376基因组中扩增得到小麦PCNA基因启动子片段,并命名为TaPCNA启动子. PlantCARE启动子在线分析软件预测含有光应答调控元件（Box I）、脱落酸应答元件（ABRE）、花粉发育应答元件（GGTT motif,GTGA motif）及细胞周期转换结合位点（E2F-binding site）等.为了分析其启动子活性, 通过替换pBI121载体上的CaMV35S启动子,构建了TaPCNA启动子与β-葡糖醛酸酶（GUS）基因的融合表达载体,通过农杆菌介导法在烟草叶片中进行瞬时表达. GUS组织化学染色结果表明,TaPCNA基因启动子能够驱动GUS基因在烟草叶片中表达,证实了所获得的启动子序列具有启动活性.本研究通过hiTAIL-PCR法克隆得到TaPCNA基因的启动子,为深入研究该基因的功能奠定了基础.     

小麦TaLhca基因的克隆及表达分析

为了从分子水分研究小麦的光合作用,该研究采用RT-PCR方法,从小麦品种‘百农207’的叶中克隆到1个捕光叶绿素a/b结合蛋白基因,命名为TaLhca。序列分析结果表明,TaLhca的编码区序列(coding DNA sequence,CDS)长810 bp,编码269个氨基酸,推测分子量为29.31 kD,等电点为8.69。TaLhca被定位于叶绿体,无信号肽,存在3个明显的跨膜区域,预测其蛋白结构含有典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域(chlorophyll a/b binding domain),为亲水性非分泌蛋白。蛋白序列比对和进化树分析表明,小麦与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)和水稻(Oryza sativa)中的Lhca序列相似性最高,亲缘关系最近。启动子顺式作用元件预测表明,启动子区域包含多个光响应元件及逆境响应元件。实时荧光定量PCR分析表明,TaLhca基因在小麦根、茎、叶中均有表达。其中在叶中表达量最高,在根中表达量最低,且受NaCl、干旱、ABA、H2O2和低温胁迫表达增强,受黑暗胁迫表达降低。该研究结果为进一步解析小麦光合作用机理及其相关基因的诱导表达特性提供了依据。     

小麦TaWRKY47基因的克隆与表达分析

为了探究小麦WRKY基因的功能,该研究采用RT PCR方法,在小麦叶片组织中克隆WRKY基因,并对其进行生物信息学和不同逆境胁迫下的表达分析。结果表明：(1)成功克隆得到1个小麦WRKY基因,命名为TaWRKY47。(2)TaWRKY47基因开放阅读框长度为900 bp,编码299个氨基酸,含有一个WRKY保守结构域和一个C₂HC锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅲ类成员。(3)亚细胞定位分析结果显示,TaWRKY47蛋白定位于细胞核。(4)荧光定量PCR结果表明,TaWRKY47基因在小麦根、茎、叶、雄蕊和雌蕊中均有表达,其中在雌蕊中表达量最高,且受低温、干旱、盐、ABA和H₂O₂等胁迫表达增强,推测TaWRKY47基因参与了小麦的逆境胁迫过程。该研究结果为进一步研究TaWRKY47基因功能与抗逆机制奠定了理论基础。